血栓性血小板减少性紫癜/溶血性尿毒症综合征的研究进展

　　作者：齐云晓 作者单位：广卅医学院附属二院

　　【关键词】 ADAMTS13 血栓性微血管病(TMA) 血栓性血小板减少性紫癜 vWF裂解蛋白酶

　　1 历 史

　　1924年Eli Moschwitz报道了一名16岁患者在突然起病后2周内死亡，症状有点状出血、皮肤苍白、发热、麻痹、血尿和昏迷[1]。尸检时发现其微血管内有散在由血小板构成的玻璃样血栓，主要分布在小动脉和毛细血管。目前仍以Moschwitz病命名或称为血栓性血小板减少性紫癜(TTP/HUS)[2]。1966年由Amorosi 和Ultmann[3]确定了该病的5个临床特征，目前仍被认为是TTP/HUS的主要诊断标准，即：① 微血管病性溶血性贫血(外周血涂片中常见到破碎红细胞);② 血小板减少;③ 神经系统症状和体征;④ 肾功能障碍;⑤ 发热。1955年Gesser等[4] 报道的5例儿童溶血性尿毒症综合征(HUS)在临床上是一种与TTP极为相似的疾病。TTP常在成年人发病，主要表现为神经系统症状;HUS常在儿童发病，主要表现为肾衰，目前这种差别在国际上没有被接受。TTP常发生于先前健康的人，儿童HUS发病前常与感染志贺菌属大肠杆菌O157:H7导致的出血性结肠炎有关，此种病目前被认为是典型的(腹泻阳性的或D+)HUS[5]。 另外与妊娠相关的TMA、HELLP综合征、播散性癌、抗肿瘤药物如丝裂霉素C、造血干细胞移植、各种药物如环孢霉素A等人类免疫缺陷病毒感染被认为可能是TTP、HUS、TTPHUS类TTP/HUS病或继发性TTP/HUS[6]。 1982年Moake等[7]报道了4名TTP/HUS患者在疾病缓解期又出现了慢性复发，在其血浆中存在超大vWF多聚体，他们推测这些多聚体是导致微血管内血小板聚集的主要因素，而解聚酶的缺乏是导致这些患者体内持续存在超大vWF多聚体的原因。 1996年，Furlan等[8]和Tsai[9]同时分离了一种血浆蛋白酶，该酶可以从Tyr 842Met 843肽链之间重复切割成熟型vWF多聚体。大量患有TTP和HUS的病例证明了多数病人患有急性散发性TTP的患者严重缺乏vWF裂解蛋白酶，患者都有自身抗体抑制物的消失。

　　2 主要的发病机理

　　近年来随着分子生物学技术的进展，认识到vWF(von Willebrand Factor)在该病发病中的作用，发现了vWF裂解蛋白酶(von Willebrand Factorcleaving protease,vWFCP)与家族性和非家族性TTP/HUS 的关系，并弄清了其结构，阐明了其功能。 vWF裂解蛋白酶是ADAMTS家族中的新成员，是一种金属蛋白酶，位于染色体9q34。同时Levy等[10]做了一个基因组序列分析，患有家族性TTP/HUS的病人表现出严重的vWF裂解蛋白酶的缺陷,他们的家人也被检出具有同样的基因ADAMTS13。 ADAMTS13基因长度大约有37 kb,包括29个外显子和1 427个氨基酸残基编码的蛋白质[11]，包括1个信号肽，1个C末端，成对碱性氨基酸蛋白酶切割位点的短的前导肽，1个催化区具有典型的reprolysin样活性位点序列(HEXGHXXGXXHD)起协调Zn粒子作用，并可结合Ca离子(E83,D173,C281,D284),1个裂解素样结构域，1个凝血酶结构域，1个富含Cys的结构域，1个间隔区，2个CUB结构域。人血浆来源的纯化vWFCP分子质量180 ku[12],而且是严重糖基化的。各种组织的Northern印迹法表明只有肝脏组织有1个4.7 kb的mRNA转录体，原位杂交表明ADAMTS13主要在肝窦状隙周围细胞表达，最近从血小板中检出了mRNA，另外从胎盘、骨骼肌和肿瘤组织中分离出了1个短的2.4 kb的mRNA转录体。由正常血浆提纯而来的ADAMTS13显示出一系列条带，分子质量分别为180、170、160和120 ku[13]，所有的都有1个相同的N末端序列，因此可以从离C末端不同距离处切去头端。来自被转染细胞条件培养基的 ADAMTS13重组体是一个活性酶，不需要被进一步激活，体内vWF的裂解是由vWF自身调节的，只有在如微血管内的剪切应力作用下才能保证切割位点位于vWF亚基的A2带区域，且易受ADAMTS13的影响，然而通过用胍盐酸或1.5 mol/L尿素和低离子浓度使vWF部分变性。来自溶解了的转染细胞的rADAMTS13仅显示出很低的vWF裂解活性[14]。重组体DAMTS13和由血浆来源的ADAMTS13能特异性地从Tyr1605Met1606裂解重组体或由血浆来源的vWF,把rADAMTS13或血浆来源的ADAMTS13和rvWF一起培养，可以产生典型的三联体结构，这种结构与在血浆中见到的vWF多聚体一样。Zheng等[15]和Soejima等[16] 通过切掉C末端区域构造了一个rADAMTS13缺失的突变株，在一个体外系统中切掉CUB域和凝血酶敏感素1重复28可以导致vWF裂解蛋白酶活性轻度地丧失，再进一步切掉间隔区域可导致酶活性完全丧失。相反在一个缺乏成对碱性氨基酸蛋白酶和分泌前导肽的细胞因子rADAMTS13可以显示出正常的vWF裂解活性。

　　3 ADAMTS13的测定

　　几个评价ADAMTS13活性的实验测定法已经被提出。其依据是降解纯化的或血浆来源的或ADAMTS13重组体[1]用SDS琼脂糖凝胶电泳和免疫印迹法测定大的vWF多聚体的降解[2]，测定C末端vWF蛋白水解片断产生二硫化物链接的同型二聚体，在所有这些测定法中ADAMTS13裂解位点位于ADAMTS13多聚体的Tyr1605Met1606，通过用胍盐酸或1.5 mol/L尿素和低离子浓度使vWF部分变性，钡或钙离子被用于激活ADAMTS13。 关于这些方法实用性的争论很大，研究表明一般关于重度ADAMTS13缺乏，实验室测定一致性较好，而方便的胶原结合实验会出现一些错误的结果：2个假阳性被被诊断为严重缺乏，1个不能检测到严重缺乏，而且在实验室测定中关于是轻微减少还是正常活性的样本的一致性不是很好。另有方法可以在潜伏期测出ADAMTS13抑制物，但灵敏度不高。 Dong等[17]提出了一个更加符合生理的测定ADAMTS13活性方法，是建立在Tsai等实验的基础之上的，切应变力增强了vWF的蛋白水解作用，他们用相似的培养灌注系统来分析血浆除去存在于受刺激内皮细胞上的附着于ULvWF串上的血小板的能力，这种方法的优越性是：它不仅可以检测ADAMTS13的蛋白水解活性而且还可以检测ADAMTS13在流动状态下黏附于vWF和/或内皮细胞下的能力。比在静止状态下裂解部分变性的vWF多聚体的方法要好，但是这种实验比较复杂而且在上面提到的多聚体研究中该实验的重复性不是很好，10个严重缺乏ADAMTS13的样品中只有7个被正确地鉴定出来，而10个复发的有40﹪ADAMTS13活性的样品中有3个没被判断为严重的缺乏。Kokame等提出用vWFA1A2A3重组体或rvWFA2域作为底物，可以表达一系列vWF肽重组体，包括裂解位点Tyr1605Met1606，而且还认为一个包括从15961618Arg73个氨基酸的肽段作为ADAMTS13裂解有效最短底物，该实验可以改善静止状态下测定ADAMTS13活性的方法。加上N和C端谷胱甘肽S转移因子和组氨酸腺嘌呤通过聚丙烯酰氨凝胶电泳、底物提纯，检测裂解产物大为简化。这种GSTvWF73H肽能灵敏地测定只有3﹪正常血浆的ADAMTS13活性。 另外，检测ADAMTS13抗原活性的方法和用酶联免疫吸附实验检测抗ADAMTS13自身抗体的方法已经被提出，通过ELISA已经发现了高滴度的针对ADAMTS13的IgG自身抗体，然而功能性的实验尚不能显示这种血浆中vWF裂解蛋白酶抑制物的存在，表明一些非抑制性自身抗体的病人是通过加速酶的清除率导致严重的ADAMTS13缺乏的。

　　4 临床分类

　　4.1 家族性TTP/HUS 1978年Upshaw发现：一个年轻女病人反复发作严重的微血管病性溶血性贫血和血小板减少是因为先天性缺乏一种能抑制血管内溶血和血小板减少的血浆因子，这一因子在1997年在患有慢性复发性TTP/HUS的弟兄两个体内被鉴定出并命名为vWF裂解蛋白酶。该病的发病有一个显著的年龄相关性：大约一半的病人在新生儿期和5岁时发病，而另一半在20～40岁的成年期发病，常被延迟诊断或误诊。有的表现为急性肾衰，有的为脑血管局部缺血，还有的为复发的溶血性贫血和血小板减少。在ADAMTS13没有被认识之前的早期报道中，TTP和HUS被认为是可以在同胞中同时存在的，这就表明临床上TTP和HUS不能被明确地区分开。Levy等人研究证实了大多数甚至全部家族性TTP/HUS发病的基本分子机制是ADAMTS13的基因缺陷，发现ADAMTS13的12种不同突变，涉及所研究的15个等位基因中的14个。此突变的遗传方式可能是显性的也可能是隐性的，但都有vWF裂解活性的缺乏，具体的突变部位尚不确定。到目前为止，基因型和表型没有相关性，疾病的严重性，器官的趋向性，发病的年龄都是很明显的，需要遗传的或环境的触发因子才会发病，来自两个家庭的2对同胞姐妹首次发病是在妊娠期，而他们的有蛋白酶缺乏的弟弟在超过35岁时仍没有症状[18]，可以推测妊娠是导致TTP/HUS的一个触发因子。

　　4.2 获得性TTP/HUS 急性获得性TTP/HUS和家族性TTP/HUS的患者，急性发作的临床症状相似而且病情严重，如果不予治疗有很高的死亡率，故必须尽快诊断。同时具备典型的症状和体征很少见，只要患者出现不能用其他疾病解释的溶血和血小板减少就可以拟诊。 自身抗体介导的vWFCP的缺乏可以作为一项实验室标准，诊断获得性TTP/HUS具特异性 [19] 。 在Oklahoma登记的TTP/HUSHUS患者中，142个可疑TTPHUS的患者在1996年到2001年接受了血浆置换治疗，用他们入院时保存的血清标本做ADAMTS13测定[20]，48个患有获得性TTPHUS，16个患有严重的ADAMTS13缺乏。32个有适度降低，除外急性肾衰在无严重ADAMTS13缺乏的患者比那些严重缺乏的患者有更高的发生率外,临床上对血浆疗法的反应及预后没有明显差别。然而有严重ADAMTS13缺乏的患者有更高的复发率。在造血干细胞移植后的TMA患者和癌症或抗癌药治疗相关的TMA有相当的ADAMTS13活性，相反由噻氯匹 或氯吡格雷诱导的TMA被报道与自身抗体介导的严重ADAMTS13缺乏相关，产后或妊娠相关的TMA，D+HUS和严重ADAMTS13缺乏常不相关。5 TTP/HUS的治疗TTP/HUS的治疗包括： ① 消除病因和诱因;② 糖皮质激素治疗; ③ 输注血浆或血浆置换;④ 使用抗血小板药物;⑤ 脾切除;⑥ 对症支持疗法。血浆置换是一个有效的疗法，最近发现在许多急性TTP/HUS的患者存在严重的自身抗体介导的ADAMTS13缺乏。血浆置换的病理生理基础是除去自身抗体，新鲜冰冻血浆可以补充缺乏的蛋白酶和皮质类固醇，可以抑制自身抗体的形成，缺乏大的血浆vWF多聚体的皮质类固醇已经被用做血浆替代品。对那些血浆置换难于治疗的或治疗后复发的TTP/HUS患者可以加大血浆置换频率，每日2次。在复发后缓解期用脾切除术常被认为是有效的方法，主要机理是除去了产生自身抗体的B淋巴细胞。最近有报道由自身抗体介导的ADAMTS13缺乏导致复发的患者在接受利妥昔单抗治疗短期有效。皮质类固醇、其他的抗肿瘤药物或脾切除治疗是否能达到长期缓解还需在预试验中被进一步证实。对那些临床上被诊断为TTP/HUS却没有自身抗体介导的ADAMTS13严重缺乏的患者是否应接受血浆置换治疗仍存在很大争议。日本的回顾性研究12例TTP/HUS患者中有10例伴有严重的获得性ADAMTS13缺乏的患者幸存了下来，而6例不伴有严重缺乏的患者中，即使已经接受了血浆置换治疗，仍有4例死亡。相比之下由Vesely等报道的48例TTP/HUS患者中，伴有严重获得性ADAMTS13缺乏的患者中有3例死亡，不伴有ADAMTS13严重缺乏的32例患者中有7例死亡，因此从后者看来血浆置换还是有效的。由纯合子或二倍体杂合子ADAMTS13基因缺陷导致的家族性TTP/HUS可以只用单纯的血浆输注来治疗，而且每2～3周有规律的新鲜冰冻血浆输注可以防止复发，有些患者在许多年后有频繁的复发。腹泻阳性的HUS患儿普遍采用肾透析作为支持治疗，尚没有发现血浆输注或置换可以改善预后者。凝血酶抑制物可能是一种治疗的策略，但仍需深入研究。对于造血干细胞移植相关性或癌症相关性的TMA，有效治疗方法尚需探索，常用治疗方法如血浆置换不能使严重患者的病死率改善，究竟是由于潜在的肿瘤还是由TMA自身引起尚不清楚。

　　【参考文献】

　　[1] MOSCHCOWITZ E. Hyaline thrombosis of the terminak arterioles and capillaries: a hitherto uanescribed disease[J]. Proc N Y Pathol Soc，1924，24: 2124.

　　[2] HOSLER GA, CUSUMANO AM, HUTCHINS GM. Thrombotic thrombocytopenic purpura and hemolytic uremic syndrome are distinct pathologic entities. A review of 56 autopsy cases[J]. Arch Pathol Lab Med，2003，27:834839.

　　[3] AMOROSI El, ULTMANN JE. Thrombotic thrombocytopenic purpura: report of 16 cases and rewiew of the literature[J]. Medicine (Baltimore) ，1966，45:139159.

　　[4] GASSER C,GAUTIERr E,STECK A,et al.Hamolytischuramische Syndrome: bilaterale Nierenrendennekrosen beiakuten erworbenen hamolytischen Anamien[J]. Schweiz Med Wochenschr，1955，85:9599.

　　[5] GRIFFIN PM,TAUXE RV.The epidemiology of infecttions caused by Escherichia coli O157:H7,other enterohemorrhagic E. coli, and the associated hemolytic uremic syndrome[J]. Epidemiol Rev，1991，13:6098.

　　[6] GEORGE JN,How I treat patients with thrombotic thrombocytopenic purpurahemolytic uremic syndrome[J].Blood，2000，96:12231229.

　　[7] MOAKE JL, RUDY CK,TROLL JH, et al. Unusually large plasma factorⅧvon Willebrand factor multimers in chronic relapsing thrombotic thrombocytopenic purpura[J].N Engl J Med，1982，307:14321435.

　　[8] FURLAN M, ROBLES R,LAMMLE B. Partial purification and characterization of a protease from human plasma cleaving von Willebrand fator to fragments produced by in vivo proteolysis[J].Blood，1996，7:42234234.

　　[9] TSAI HM.Physiologic cleavage of von Willebrand factor by a plasma protease is dependent on its conformation and requires calcium ion[J].Blood，1996，87:42354244.

　　[10] LEVY GG, NICHOLS WC,LIAN EC,et al.Mutations in a member of the ADAMTS gene family cause thrombotic thrombocytopenic purpura[J].Nture，2001，413:488494.

　　[11] PLAIMAUER B,SCHEIFLINGER F.Expression and characterization of recombinant human ADAMTS13[J].Semin Hematol，2004，41:2433.

　　[12] PLAIMAUER B, ZIMMERMANN K, VOLKEL D,A et al.Cloning, expression, and functional characterization of the von Willebrand factorcleaving protease(ADAMTS13) [J].Blood，2002，100: 36263632.

　　[13] SUZUKI M,MURATA M,MATSUBARA Y, et al. Detection of von Willebrand factor cleaving protease in human platelets[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2004，313:212216.

　　[14] SCHNEPPENHEIM R, BUDDE U, OYEN F, et al. Von Willebrand factor cleaving protease and ADAMTS13 mutations in childhood TTP[J].Blood，2003，101：18451850.

　　[15] ZHENG X， NISHIO K，MAJERUS EM， et al. Cleavage of von Willebrand factor requires the spacer domain of the metalloprotease ADAMTS13[J].J Biol Chem， 2003，278: 3013631041.

　　[16] SOEJIMA K, MATSUMOTO M, KOKAME K, et al. ADAMTS13 cysteinerich/spacer domains are functionally essential for von Willebrand factor cleavage[J]. Blood ，2003，102: 32323237.

　　[17] DONG JF, MOAKE JL, NOLASCO L, et al. ADAMTS13 rapidly cleaves newly secreted ultralarge von Willebrand factor multimers on the endothelial surface under flowing conditions[J]. Blood， 2002，100: 40334039.

　　[18] FURLAN M, LAMMLE B. Aetiology and pathogenesis of thrombotic thrombocytopenic purpura and haemoltytic uraemic syndrome:the role of von willebrand factorcleaving protease[J]. Best Pract Res Clin Haematol ，2001，14:437454.

　　[19] MOAKE JL,CHOW TW. Thrombotic thrombocytopenic purpura:understanding a disease no longer rare[J].Am J Med Sci，1998，316:105119.

　　[20] ESELY SK, GEORGE JN, LAMMLE B, et al. ADAMTS13 activity in thrombotic thrombocytopenic purpurahemolytic uremic syndrome: relation to presenting features and clinical outcomes in a prospective cohort of 142 patients[J]. Blood，2003，102:6068.