HIF1、VEGF与缺血性脑血管病

　　作者：王钟秀 杨林花 作者单位：山西医科大学第二医院血液科 太原030001

　　【关键词】 缺氧诱导因子1; 血管内皮生长因子; 新生血管形成

　　世界平均脑血管病的发病率为190～200/10万，而我国高达280/10万，其死亡率超过100/10万。脑血管疾病居高不下的致残率更是影响人类提高生活质量和制约社会经济发展的巨大障碍。因此必须研究它的病理生理机制，寻找新的治疗策略。缺血性脑血管病是因血管堵塞致局部脑血流量下降，氧合营养转运障碍，最终导致组织缺氧和细胞死亡。此时机体需作出反应维持机体氧的平衡与稳态来抵抗这种不利因素。其中一种重要机制就是诱导新生血管形成，改善侧支循环，增加脑血流。但新生血管形成是一个非常复杂的生物学过程。

　　1 HIF1、VEGF的结构与生物学活性缺氧诱导因子1(hypoxia inducible factor1, HIF1)是由Semenza 〔1〕1992年在缺氧诱导的细胞核提取物中发现的一种异源二聚体转录因子，由120 ku的α亚基和91～94 ku的亚基组成，HIF1α基因位于14号染色体(14 q 2124)。HIF1 基因位于1号染色体((1 q 21)。HIF1α是唯一的氧调节单位，它决定HIF1的活性。而HIF1 则与结构稳定性有关。常氧状态下，细胞虽然不断合成HIF1α，但由于受泛素蛋白酶体系统(ubiquitinproteasome system)作用迅速降解，很难检测到。缺氧时，通过抑制其降解提高HIF1α蛋白水平，并转移至细胞核内与HIF1 结合形成有活性的HIFl，进而启动靶基因的表达〔2，3〕，介导组织细胞产生一系列的缺氧适应反应〔4〕：诱导血管内皮细胞生长因子、胰岛素样生长子2等基因表达，促进血管生成;诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)、血红素氧合酶1(HO1)，发挥扩张血管作用;诱导红细胞生成素(erythropoietin,EPO)，使红细胞生成增加，提高携氧能力;诱导糖酵解酶、转铁蛋白等基因表达，促进无氧代谢。以上对血管生成、激素代谢、能量代谢方面发生的调节作用对脑缺血后的神经损伤有保护作用，在脑缺血损伤和保护机制中起重要作用〔5〕。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是由Ferrara等〔6〕在1989年从牛垂体滤泡星状细胞的条件培养基中纯化出来的一种具有肝素结合活性的生长因子,为相对特异的血管内皮细胞促有丝分裂原，由于其同时具有增加血管通透性的作用，又被称为血管通透因子( vascular permeability factor, VPF)。其分子量为40～45 ku,基因定位于6号染色体短臂(6 p 21.3)，全长约14 kb，含8个外显子和7个内含子，由于VEGF基因外显子的不同剪接形成至少5种不同的mRNA，分别表达5种VEGF蛋白：VEGF121,VEGF145,VEGF165,VEGF189,VEGF206。近年发现，VEGF实际上是一族结构上具有同源性的蛋白，将上述各种VEGF异构体统称为VEGFA。迄今又已发现了VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGFE。在体内VEGFA和VEGFB均有促进缺血组织血管生成的作用。VEGFE与VEGFA也有十分相似的生物学作用，如促进血管内皮细胞分裂，增加血管通透性以及在体外和体内促进血管生成的作用。VEGFC对于淋巴管生成有重要作用。VEGFD的结构与VEGFC较为相近，可能影响VEGFC促进淋巴管生成的过程，近期研究提示VEGFD能够促进家兔角膜血管生成。VEGF通过与细胞表面的特异受体结合而发挥作用。目前所知的VEGF受体有2种，包括fam样酪氨酸激酶受体(Fltl/VEGFR1))和含有激酶插入域的受体(KDR/Flkl/VEGFR2)。VEGFR1对于内皮细胞的形态发生及调节发挥重要作用，VEGFR2(FLK1)与VEGF有高亲和性，被认为是内皮细胞基本的VEGF受体形式，对于血管的新生和内皮细胞的增殖发挥重要作用。VEGFR1主要结合VEGFA和VEGFB,VEGFR2可与VEGFC、VEGFD和VEGFE结合。VEGF家族均具有信号肽序列，可以主动地分泌至细胞外而发挥生物学效应。可直接作用于内皮细胞，诱导血管再生，能促进新生血管形成，并能增加血管通透性。通过与受体结合后一方面促进微血管内皮细胞增殖、迁移，另一方面促使微血管通透性增加，使纤维蛋白外渗，并与其他蛋白质如纤维连接蛋白等凝结成纤维凝胶，为成纤维细胞、内皮细胞和其他细胞移动侵入提供暂时的基质成分，并最终将它们转化为血管的连接组织。VEGF在人和动物胚胎发育阶段呈高水平表达，介导生理过程的血管生成。正常成年组织中表达量很少，但在肺、肾、脑等组织中仍有一定低水平的表达。而在某些病理条件下，受缺氧、低血糖及多种生长因子调节，在肿瘤血管生成、肿瘤转移、组织修复等过程中发挥重要作用。

　　2 HIF1、VEGF在缺血性脑血管病的表达HIFlα的激活是低氧反应的关键，也是脑组织低氧反应的重要信号。脑缺血、缺氧均可诱导脑缺血半暗带HIF1mRNA表达增加,并作用于一系列靶基因。轻度缺氧引起的预适应是神经细胞的保护机制之一。新生小鼠经低氧预处理，当再次遭受脑缺氧和缺血，可减轻脑梗死严重程度甚至免于脑梗死的形成，这种脑保护机制可能是通过预低氧后导致脑组织HIFlα表达增高而实现的。Bernaudin等〔7〕局灶性脑缺血前24 h常压低氧预处理成龄小鼠，发现脑梗死面积与对照组比较减少约30%。在预低氧脑组织中，除核内HIFlα过量表达外，VEGF mRNA和蛋白水平也表达增高。Pichiule等〔8〕发现心脏骤停所致全身低氧中，大脑皮层HIFlα在心跳恢复1 h后表达增高并持续12 h，VEGF mRNA在心跳恢复12～48 h后表达增高并持续7 d，VEGF蛋白水平在心跳恢复24～48 h后上升。VEGF是HIF1α的下游调节基因之一。VEGF基因5'端增强子存在有与HIF1α结合的序列-缺氧反应元件(hypoxia response element,HRE)。缺氧时HIF1α积聚并且DNA结合活性增加，HIF1α与VEGF基因的HRE结合后，促进VEGF转录和表达，并增加缺氧情况下VEGF mRNA的稳定性〔9〕。VEGF进而作用于存在于血管内皮细胞表面的VEGFR1和VEGFR2，从而激活了一系列的缺血转导通路，诱导新生血管的生成。Oosthuyse等〔10〕证实缺少HRE启动子的VEGF基因在低氧时，因新生血管减少，易致运动神经元变性。VEGF可改变细胞基质。它诱导内皮细胞表达凝血酶原激活物及凝血酶原激活物抑制剂1及组织因子、基质胶原酶等，并激发Ⅷ因子从内皮细胞释放，改变细胞外基质，使其更易于血管的生长〔11〕。VEGF可增加血管通透性。VEGF增加血管通透性被认为是通过增加内皮细胞间隙来实现的。在内皮细胞的超微结构下发现，小静脉内皮细胞胞质中有一些由囊、液泡组成的葡萄簇样结构，被称为小囊叶泡器(VVO)。每个VVO一般由12个囊、液泡组成，跨度可从内皮细胞的腔面至基底膜面。囊、液泡之间通过3层单位膜相连，此处有一个由隔膜组成的能够被开启和关闭的小窗，该窗打开时，血液中大分子物质可以从一个个囊液泡中通过，进入周围的组织间隙。免疫组化发现血管内皮细胞基底膜面和VVO中有结合的VEGF。局部注射VEGF后可观察到VVO功能增强，提示VEGF可能是通过对VVO之间窗口开启的调节而促使血管通透性增加〔12〕。VEGF增加血管通透性，使血浆蛋自溢出血管外导致血浆蛋白在血管外凝结，有利于血管形成。VEGF可促进内皮细胞的增殖。有证据显示，VEGF在体外可促进内皮细胞生长，在体内可诱导血管发生，VEGF的表达与组织中微血管密度及新生血管密度密切相关。这种作用主要是由于VEGF对血管内皮细胞的生长刺激作用和趋化作用，可提高内皮细胞中GluT1葡萄糖运输。VEGF对内皮细胞的直接作用可能是通过激活细胞上的磷脂酶，短暂地诱导Ca2+离子而发生的〔13〕。VEGF具有血管生成功能已得到公认，一般认为在血管生成过程中，内皮细胞需要表现出一系列特殊、复杂的行为，包括增殖、迁移、细胞间互相粘着、排成直线以及形成开放的腔样结构。当然，血管的生成受内部基因调控，后者又受外部调节因子的影响，但这些量化的基因调节因子如何产生立体信息指导内皮细胞产生复杂的结构变化至今尚不清楚。目前越来越多的观点认为细胞外基质在基因的调节、翻译和血管结构之间起重要作用，而血管通透性的改变对细胞外基质成分又具有重要的影响。人们发现内皮细胞在具有韧性的支持物上运动时，可使其产生皱缩，把内皮细胞接种在一种凝胶样基底膜基质上即是如此。由于运动牵拉，使得每一个内皮细胞作为一个张力中心持续地将基质牵向自己，在其周围产生放射状的牵引域，相邻细胞的牵引域互相重叠，在基质平面上产生棋盘格状结构，随着牵引张力不断增加，最后使基质由平面结构转为立体索网结构，为内皮细胞的方向性行为提供条件〔14〕。

　　3 问题与展望缺血缺氧性脑血管疾病，是一个复杂的病理过程，涉及多种基因表达、不同转录因子激活和众多因子参与。通过基因或药物手段调节其活性，维持机体氧平衡与稳态必将为临床治疗提供新的思路和方法。Semenza 等〔15〕研究发现通过基因或药物手段调节HIF1的活性，可防治心肌梗死和脑缺血。最近Zhang等〔4〕发现维生素E在治疗脑缺血疾病中不仅有抗氧化作用，而且可以诱导 HIF1及其靶基因的表达，对脑组织形成一定保护作用。轻度缺氧激活的HIF l可促进目的基因如VEGF、EPO等生成，从而促进缺氧组织细胞对缺氧的耐受，保障细胞存活。然而，当缺氧严重并持续存在时，HIFlα可与肿瘤抑制蛋白p53结合，使p53稳定性增强，导致caspases激活，可能促进了缺氧诱导的细胞凋亡。越来越多的研究表明，脑缺血低氧性神经元死亡有坏死和凋亡两种方式，早期脑缺血低氧引起的神经元死亡以坏死为主，而继发性神经元死亡以凋亡为主。神经元凋亡以缺血后3 d最为明显，可持续到缺血低氧21 d。说明低氧诱导的神经细胞凋亡在脑缺血缺氧损伤的病理过程中起着重要作用。在HIF lα缺陷的胚胎干细胞或大脑皮层神经元中低氧并不能诱导神经元凋亡，因此HIFlα被认为是低氧控制细胞凋亡的重要介质之一。在控制细胞周期中，编码肿瘤抑制蛋白p53的基因是HIF 1α依赖型的。此外，低氧条件下迅速生成的前凋亡蛋白Nip 3是一种细胞死亡因子，亦是由HIF lα诱导生成的。故HIFlα激活是脑组织低氧缺血的结果，也极可能是迟发性神经元死亡过程所必需的。HIF1通过作用于不同靶基因发挥不同的效应，从而在脑缺血缺氧损伤中具有双重角色，这可能与缺氧持续的时间及程度有关。轻度缺氧时可使HIF  1的复合物稳定，引起VEGF等基因表达，但在持续严重缺氧时，稳定的复合物使细胞内p53水平增加，促进有关病理基因的表达，从而导致神经毒性。有关的详细机制还需进一步研究和探讨。VEGF能促进缺血区侧枝循环的建立。其治疗作用已由一系列动物实验证实：Isner等〔16〕应用VEGF及其基因对大白兔慢性后肢动脉缺血模型进行处理，证明VEGF能促进缺血肢体侧支循环的形成并达到治疗缺血的效果。血管形成细胞因子，如酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胸苷磷酸酶、转化生长因子 (TGF)、肿瘤坏死因子(TNFα)、炎症因子IL8、表皮生长因子、及PDGF，HGF等已被广泛认为可用于治疗缺血性心脏病，有促进内皮的动脉保护作用;然而许多研究认为新生血管能够促进动脉粥样硬化斑块发展，是引起斑块不稳定乃至破裂导致血栓的重要因素。从理论上讲，高胆固醇血症或血管损伤等因素导致血管内膜增厚一旦超出某个临界值，则无论是从管腔还是外膜滋养血管到达中膜和新生内膜的距离都会增大，因而限制了氧及其它营养成分对这两层膜的供应。一项对兔球囊损伤髂股动脉进行的研究发现，损伤后的动脉壁氧供减少，但后来由于外膜形成新的滋养血管而得以代偿。组织与毛细血管(或血管腔)之间的距离超过100 μm时，动脉内部将形成缺氧微环境，进而引起低氧诱导因子HIF1α积聚，后者诱导VEGF及其它血管形成调节因子表达。VEGF分泌后促进血管形成，导致中膜和新生内膜氧供增加，从而加快斑块生长。业已发现动脉粥样硬化损伤部位中有VEGF、FGF和HIF1α表达，与上述假说相吻合。但是最近人们开始另辟新径思考斑块不稳定的原因。已知血管平滑肌细胞数量较多的病变部位稳定性较高，而细胞相对缺乏的部位常常出现较多的钙化、纤维化和脂质成分，易于发生破裂。因此人们推测，新血管生成可能增加斑块核心的营养供应，引起斑块中细胞含量增高，从而起到稳定斑块的作用;另一方面，新血管生成也会使斑块内出现微血管通道，这些微血管脆性较高且易于出血。病理研究发现斑块中确有纤维蛋白、纤维蛋白裂解产物和含铁血黄素沉积，证明存在斑块内出血。血栓形成后产生凝血酶，后者引起PDGF大量释放，进而促进血管平滑肌细胞迁移与增殖。活化后的血小板还能激活转化生长因子β，后者能够刺激血管平滑肌细胞合成间质胶原。因此，斑块新血管生成以及其后发生的微血管出血将会促使斑块增大，既会引起斑块稳定性增高，也可能导致稳定性降低。许多实验性研究也发现，VEGF对动脉内皮细胞具有保护作用。VEGF抑制性抗体阿瓦斯丁(avastin)或贝伐单抗(bevacizumab)治疗肿瘤的临床试验表明，大约5%的阿瓦斯丁治疗组患者血栓栓塞危险性增高，包括脑血管病、心肌梗死以及深静脉血栓形成。如果这一研究结果能够得到进一步证实，则说明内源性VEGF对于成人血管可能具有保护作用。由于VEGF具有多种生物学功能，而且内皮完整性对于维持血管功能十分重要。促进血管形成的方法用于治疗缺血性心脑血管病的前景似乎更好一些，但是还需要明确的临床研究证据支持。

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