高效液相色谱法测定兔血浆中黄芩苷的含量

　　作者：蒋晪，王鹏娇, 张敏，高秀丽 作者单位：贵阳医学院 药学院， 贵州 贵阳 550004

　　【摘要】目的： 建立测定兔血浆中黄芩苷的含量测定方法。方法： 用PEG400-2%偏磷酸沉淀血浆蛋白,离心后取上清液进行色谱分析。色谱柱为Diamosil-C18,流动相为乙腈-0.1%磷酸(25∶75,V/V),流速为1 ml/min,检测波长275 nm。结果: 黄芩苷的质量浓度在0.087 22～2.907 5 mg/L (r=0.989 9);低、中、高3个浓度的质量控制(QC)样品的相对回收率分别为96.3%、97.3%和96.6%。结论: 方法简便快速,适用于黄芩苷的血药浓度测定及药代动力学研究。

　　【关键词】 黄芩甙; 色谱法，高压液相; 血浆; 免

　　Determination of Baicalin Concentration in Rabbit Plasma by RP-HPLC

　　JIANG Qian, WANG Pengjiao， ZHANG Min， GAO Xiuli

　　School of Pharmocology, Guiyang Medical College, Guiyang 550004, Guizhou, China

　　[Abstract] Objective: To establish a biopharmaceutical analytical method for the determination of baicalin in plasma by RP-HPLC. Methods: Rabbit plasma proteins were precipitated with PEG400-2%metaphosphoric acid and the supernatant liquid obtained from the serum by centrifuge was subjected to chromatographic analysis. The analytical column was Eclipse XDB-C18, and the mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid (25∶75, V/V) with a flow rate of 1ml/min. The detection wavelength was 275 nm. Results：The linear range of baicalin in rabbit plasma was 0.087 22～2.907 5 mg/L (r=0.989 9).Three relative recoveries of baicalin represented low, middle and high concentrations were 96.3%，97.3%and 96.6% respectively. Conclusion: This method is accurate, reliable and simple and is suitable for the pharmacokinetic study of blood concentration of baicalin.

　　[Key words] baicalin; chromatography,high pressure liquid; plasma; rabbits

　　黄芩为唇形科多年生草本植物黄芩的根，主要含有黄芩苷、黄芩素等多种黄酮类化合物[1]。黄芩苷作为黄芩的主要有效成分之一，属葡萄糖醛酸苷类,具有广泛的药理作用，除传统意义上的抗炎、抗变态、抗病毒以及解热和保肝作用外,近年来,黄芩苷新用途的开发与研究日渐深入[2]。黄芩苷具有清除氧自由基、减轻组织缺血再灌注损伤、促进细胞凋亡以及抗肿瘤等多方面的作用[3]。黄芩苷具有多种药理活性，在中药中的应用非常广泛，用量也特别的大，但相关报道其生物利用度较低[4]。因此，在传统种植、提取及含量测定研究的同时，建立黄芩苷的血药浓度测定方法，研究其体内代谢过程，具有十分重要的基础和临床意义。2007年4月对兔血浆中黄芩苷的含量测定方法进行了研究，并测定了灌胃后家兔体内黄芩苷浓度，同时对其进行了相应的药代动力学分析。

　　1 仪器与试药

　　Agilent1100系列高效液相色谱仪(四元泵、可变波长检测器、自动进样器、柱温箱、化学工作站B.01.01C版)，TGL-16C离心机(上海安亭科学仪器厂);黄芩提取物(含黄芩苷90%，四川省玉鑫药业有限公司)，黄芩苷对照品(中国药品生物制品检定所,批号110715-200514);乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。实验用兔由贵阳医学院动物中心提供。

　　2 方法与结果

　　2.1 色谱条件

　　色谱柱: Diamosil-C18 (250 mm×4.6 mm,5 μm)，Phenomenex-C18保护柱(3 mm×4.6 mm,5 μm);流动相：乙腈-0.1%磷酸(25∶75，V/V);流速:1 ml/min;检测波长：275 nm;柱温:40 ℃;进样量:50 μl。

　　2.2 血浆样本处理

　　取待测血浆0.2 ml,加入PEG400 0.2 ml,2%的偏磷酸0.2 ml，涡旋混合30 s沉淀蛋白,高速离心(16 000 r/min)10 min,取上清液50 μl进样测定。

　　2.3 检测

　　限在2.1的色谱条件下,样品按上述方法操作，得黄芩苷的最低检测浓度为0.029 08 mg/L(S/N≥3)。

　　2.4 方法专一性

　　在2.1的色谱条件下,样品按上述方法操作,比较空白血浆，空白血浆加黄芩苷对照品、血浆样品,考察方法的专一性。结果见图1。

　　2.5 标准曲线的绘制

　　精密吸取空白血浆0.2 ml，分别加入标准系列的黄芩苷对照品溶液，按血浆样品的处理方法操作，制成相当于黄芩苷浓度为0.087 22 mg/L、0.145 4 mg/L、0.290 8 mg/L、0.581 5 mg/L、1.163 mg/L、2.907 5 mg/L的血浆溶液，进样50 μl测定。将黄芩苷峰面积(A)对浓度(C)进行回归，得直线回归方程为：A=60.952 37×C+3.982 52，r=0.998 9。由此可表明该方法在0.087～2.900 mg/L浓度线性关系良好。

　　2.6 回收率试验

　　取空白血浆200 μl,按“标准曲线”条件项下方法配成低、中、高3个质量浓度(分别为0.087 22 mg/L、0.290 8 mg/L、2.908 mg/L)的QC样品各3份, 按样品处理方法处理后进行测定,同时配制相同浓度的黄芩苷标准溶液进行测定。与血浆样品结果对比，得到低、中、高3个浓度的QC样品的相对回收率，分别为96.3%、97.3%和96.6%。

　　2.7 精密度试验

　　日内精密度：配制含黄芩苷浓度为0.087 22、0.290 8和2.908 mg/L的QC样品各3份，在同一天内进行样品的处理和测定，得3个浓度QC样品的RSD，分别为2.37%、1.04%和0.92%。日间精密度：按上法配制QC样品各3份，在3 d中进行相同的处理和测定，得3个浓度QC样品的RSD，分别为5.86%、3.92%和2.58%。

　　2.8 稳定性试验

　　上述样品于回收率试验后，放置于4 ℃冰箱，10 d后复测，色谱峰面积变化不大，可见血浆样品10 d内在4 ℃条件下稳定。

　　2.9 血药浓度测定

　　健康家兔3只,经灌胃予黄芩提取物90 mg/kg，给药后0.083、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0 h定时静脉取血0.5 ml。分离血浆,取0.2 ml血浆按“血浆样品处理”条下操作,测定黄芩苷含量(见图2)。实验数据采用3P87药代动力学方程进行曲线拟合,权重因子为1/C2(C为血药浓度),所得药代动力学参数见表1。表1 黄芩苷的主要药代动力学参数(略)注：C为血药浓度，AUC为血药浓度曲线下面积

　　3 讨论

　　3.1 流动相溶剂的选择

　　在0.4%磷酸-甲醇系统中，空白血浆的背景影响大于0.1%磷酸-乙腈的系统影响。同时以0.4%磷酸和0.1%磷酸对黄芩苷峰型的影响无明显区别，而0.1%磷酸-乙腈系统的pH值在5左右， 0.4%磷酸-乙腈pH值在3左右，用0.1%磷酸-乙腈系统更有益于色谱柱的保护，因此，选用0.1%磷酸-乙腈系统做为生物样品中黄芩苷分析的洗脱系统[5]。

　　3.2 兔血浆中蛋白质的处理

　　考虑到样品处理的简便、快速，首先选用蛋白质沉淀法，选取过甲醇、乙腈、丙酮、中性盐和加热沉淀法，均不能满足实验要求[6，7]。偏磷酸是一种酸性沉淀剂，其作用机制是使蛋白质分子的阳离子形成不溶性盐而沉淀。实验选取1%、2%、5%的偏磷酸做为蛋白质沉淀剂，比较后发现用偏磷酸沉淀蛋白，黄芩苷的峰型很好，理论塔板数较高，但样品的绝对回收率很低，且随着偏磷酸的浓度增高，绝对回收率逐渐降低。通过先加入PEG400再加入偏磷酸沉淀蛋白质的方法可改善黄芩苷的回收率，使其符合要求。4

　　【参考文献】

　　[1]马爱团，钟秀会，蒙立根.黄芩黄酮药理研究概况[J].中国兽医杂志，2006(42)：39-40.

　　[2]陈秀清,齐香君,何恩铭.中药黄芩研究新进展[J].食品与药品,2006(8):23-27.

　　[3]高中红，黄开勋，许辉碧.黄芩黄酮对自由基的清除作用的ESR研究[J].华中理工大学学报，1999(27)：97-99.

　　[4]王玉英.黄芩苷的吸收及药动学研究进展[J].中草药，2005(9)：44-45.

　　[5]李再新，吴小红.HPLC法测定复方水杨酸酊双组分含量[J].实用临床医药杂志，2008(4)：54-55.

　　[6]任天池，曹春林.血浆中黄芩甙的HPLC测定方法[J].中国实验方剂学杂志，1998(4)：4-6.

　　[7]仇峰,何仲贵,程杉,等.RP-HPLC法测定兔血浆中黄芩苷含量[J].沈阳药科大学学报,2002(19)：189-192.