血p53蛋白对肺癌诊断价值的研究

　　作者：沈巨信 秦娥 周国忠 韩东方 贺群 孙健 作者单位：312000 浙江省绍兴市人民医院

　　【关键词】 蛋白对肺癌

　　肺癌发病率逐年增高，早期诊断对提高患者生存率至关重要。p53蛋白是肺癌相关基因p53基因编码的核酸蛋白，在癌变的早期阶段，即可在血液中出现[1]。本研究采用新技术-流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)，分析FCM定量检测肺癌患者血细胞中p53蛋白水平，探讨p53蛋白在肺癌诊断中的应用价值。

　　1 临床资料

　　1.1 一般资料

　　肺癌组为2006年5月至2007年8月本院确诊患者，共30例，男21例，女9例，平均年龄(60.8±10.44)岁，所有入选的患者均经纤维支气管镜(简称纤支镜)肺活检、经皮肺穿刺活检、手术等组织病理学确诊，排除接受过放、化疗或肺癌手术，有严重心肺功能障碍不能耐受纤支镜检查者。其中鳞癌16例，腺癌8例，小细胞癌6例;按国际抗癌联盟(UICC1997)分期标准进行临床TNM分期，I期6例、Ⅱ期10例、Ⅲ期9例、Ⅳ期5例。同期收集肺部良性疾病组30例为对照组，包括肺结核5例、支气管扩张6例、肺炎15例，慢性支管气炎4例，平均年龄(58.0±11.66)岁，经细菌学、影像学、病理学确诊。

　　1.2 标本采集 所有受检对象均抽肘静脉血5ml，放置-20℃冰箱内保存待检。

　　1.3 实验步骤

　　外周血细胞内p53蛋白检测 采用双色标记法，取外周血2μl EDTAK2抗凝，CD45-PCY 10μl+100μl全血，避光反应15min。PSB离心沉淀物制成悬液，用试剂intrapreptm(Immunotech公司)单细胞固定和破膜。加破膜剂Ⅰ液150μl，振荡后放15min，加FPBS离心洗涤，取沉淀物，加破膜剂Ⅱ液150μl，轻轻混匀放置5min，加20μl p53流式细胞仪检测，轻轻摇匀1～2s，放置20min，加PSB 1ml离心洗涤，上机，仪器方案“2006p53”，计数1万个细胞中p53表达百分率作为观察数据。

　　1.4 主要试剂及仪器

　　p53蛋白抗体试剂盒购自Cell Signal Technology公司。流式细胞仪由美国公司提供，型号为Coulter EPICS-XL。

　　1.5 统计学处理

　　计量资料用(x±s)表示，均数间比较采用t检验，以Excel 2000建立数据库，应用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC)分析法综合评价诊断实验的实用价值。所有统计计算及绘图采用SPSS 11.0系统软件完成。

　　2 结果

　　2.1 两组患者血p53蛋白检测水平比较

　　肺癌组(2.16±1.88)、对照组(0.93±0.51)，2组比较，差异有显著性(P<0.01)。

　　2.2 肺癌患者血p53蛋白水平与病理类型的关系

　　p53水平小细胞肺癌6例，为(4.76±2.92)、非小细胞肺癌24例，为(1.46±0.52)，2组比较，差异有显著性P<0.05。

　　2.3 p53蛋白对肺癌诊断的敏感性和特异性分析

　　以肺部良性疾病为对照组，以1-特异性作横坐标，敏感性作纵坐标，作ROC曲线(见图1)，选择诊断分界点及敏感性和特异性。用p53试剂进行检测，取诊断点为1.265，其诊断敏感性为70%，特异性为83.3%，准确率76.7%， Youden指数(Yi)为0.533。进一步计算ROC曲线下面积(Az)(见表1)，显示单个试剂p53的曲线下面积为0.793。表1 单个试剂p53的ROC曲线下面积、标准误、P值和95%可信区间(略)

　　3 讨论

　　p53基因定位于17号染色体短臂，全长20kb，共有11个外显子和10个内含子，其外显子5～8是突变热点区域，主要生物学功能为细胞周期阻滞、DNA修复、诱导细胞调亡等[2，3]。抑癌基因p53突变是人类癌症中最频发的基因事件之一，与肺癌之间存在相关关系，有报道在SCLC患者中有90%～100%发生p53基因突变，在NSCLC的各种类型如腺癌、鳞癌等患者中p53基因突变率也达50%～60%，对肺癌的早期诊断有重要意义[4]。董光同等[5]报道小细胞肺癌p53基因突变为98%，鳞癌为75%，腺癌40%，且与分期关系为Ⅰ期26%，Ⅱ期58%，Ⅲ期71.4%[5]。p53基因突变直接导致突变型p53蛋白高表达，p53蛋白作为一个细胞周期调控因子，在细胞增殖与凋亡的平衡上起着重要的作用，它的异常早于肿瘤的发生[6]。周欣等[7]报道用免疫组化方法检测肺癌患者痰p53蛋白表达,结果发现p53蛋白是肺癌发生的早期事件,在组织发生恶变后无显著关系。故检测血p53蛋白的表达可以早期检测p53基因的异常。正常情况下，p53蛋白分泌较少，很不稳定，半衰期短，普通检测方法很难检测到。而突变型p53蛋白结构稳定，半衰期延长，可在胞内大量聚集，当机体免疫力下降时，一些肿瘤细胞可逃避免疫攻击向周边浸润，部分进入血液循环，并向远处转移[8]。

　　作者采用FCM检测患者血细胞中p53蛋白，实验结果显示两组患者p53检测水平比较差异有统计学意义，肺癌组水平显著高于对照组，提示该方法可用于辅助诊断肺癌。血p53蛋白水平在小细胞肺癌组与非小细胞肺癌组比较差异有统计学意义，小细胞肺癌组p53水平明显高于非小细胞肺癌组，推测是否与小细胞肺癌恶性程度高，增殖活跃(倍增时间为33d)，早期发生血循转移，在外周血中出现癌细胞有关，有待进一步观察。

　　ROC分析是国际公认的评价诊断方法效能的客观标准，根据Swet[9]的评价标准，ROC曲线下面积为0.7～0.9 时, 表示有较好的诊断准确性，可应用于临床诊断，当面积>0.9时表示诊断准确性较高，在临床诊断中可作为重要的诊断依据。本研究显示：使用p53试剂进行检测，ROC曲线下面积为0.793，p53有较好的诊断准确性。当取p53蛋白诊断点为1.265时，其诊断肺癌的敏感性为70%，特异性为83.3%，准确率为76.7%。

　　目前关于p53蛋白检测方法多用免疫组化和酶联免疫吸附法，免疫组化需要组织标本，取材困难不易于术前诊断，酶联免疫吸附法虽因标本易取、操作简便而受到临床医生关注，但检测阳性率低，据报道阳性率仅14%～23%[10]，检测率高低受肿瘤细胞是否释放蛋白或释放的多少有关，以及释放到胞外的蛋白稳定性下降易被清除也影响到检测的阳性率。所以肿瘤细胞内虽有p53基因突变、p53蛋白积聚，但血清中不一定存在p53蛋白或浓度低而检测不到。而采用FCM直接检测细胞内p53蛋白，避免了以上缺陷，本文检测的血p53蛋白在肺癌组中阳性率达70%，明显高于对照组16.7%。因此FCM检测肿瘤具有简便、快速、准确的优点，在恶性肿瘤的诊断上具有重要意义。

　　血p53蛋白作为新型肿瘤标记物，在辅助诊断肺癌是可行的，其特异性高，在SCLC诊断价值优于NSCLC，为肺癌的无创性诊断提供了一种手段。但采用FCM检测血细胞中p53蛋白临床报道尚不多，其对肺癌的诊断价值有待进一步研究。

　　【参考文献】

　　1 Luo JC，Zehab R，Anttila S，et al. Detection of serum p53 protein in lung cancer patients. J Occup Med，1994，36(2)：155～160.

　　2 Gemba K，Ueoka H，KiuraK，et al. Immunohistochemical detection of mutant p53 protein in small-cell lung cancer: relationship to treatment outcome, Lung Cancer. 2000，29(1):23～31.

　　3 Bennett WP，Hussain SP，Vahakangas KH，et al. Molecular epidemiology of human cancer risk: gene-environment interactions and p53 mutation spectrum in human lung cancer.J Pathol. 1999，187(1):8～18.

　　4 古涛，刘永，王伟，等.肺癌端粒酶活性、p53突变蛋白及细胞增殖DNA合成期比例相关研究.徐州医学院学报，2002，22(1)：30～33.

　　5 董光同，胡咏武，高元光，等.肺癌切除组织和支气管切缘p53基因突变的研究.浙江临床医学,2001，3(4)：229～300.

　　6 Sheikh MS，Fornace AJ.Death and decoy receptors and p53-mediated apoptosis.Leukemia. 2000，14(8):1509～1513.

　　7 周欣,李龙芸,古力夏提.HnRNP A2/B1与p53在肺癌患者痰中的表达.癌症进展杂志,2006,4(2)：172～175.

　　8 Luo JC，Neugut AI，Garbowski G，et al.Levels of p53 antigen in the plasma of patients with adenomas and carcinomas of the colon.Cancer Lett. 1995，91(2):235～240.

　　9 Swets JA，Measuring the accuracy of diagnostic systems. Science，1998，240(4857)：1285～1293.

　　10 Barbati A，Mariani L，Porpora MG，et al. Serum evaluation of p53 protein in patients with gynaecological cancer.Anticancer Res. 2000，20(2A):1033～1035.