p63在Castleman病及滤泡性淋巴瘤中的表达

　　作者：金珍琳，俞康，杨开颜，黄卡特 作者单位：温州医学院附属第一医院，浙江 温州 325000，1.血液内科;2.病理科

　　【摘要】目的 ：探讨p63蛋白和p63基因两种亚型(TAp63及ΔNp63)在Castleman病(CD)及滤泡性淋巴瘤(FL)中的表达情况。方法：应用免疫组织化学法检测26例CD及18例FL中p63蛋白的表达情况，同时用逆转录聚合酶链反应技术(RT-PCR)方法检测p63两种亚型(TAp63及ΔNp63)表达情况，20例反应性增生性淋巴结炎(RHL)作为对照。结果：4例CD(4/26，15.4%)和10例FL(10/18，55.6%)、2例RHL(2/20，10%) p63表达呈阳性。p63蛋白在FL中的阳性率要明显高于CD和RHL(P < 0.05)。而p63蛋白在CD和RHL中的阳性表达率无差别(P >0.05)。RT-PCR结果显示阳性表达的均为TAp63，未见ΔNp63表达。结论 ：p63可能作为致癌基因参与了FL的发生，而在CD的发生中，p63基因可能并不起主要作用。

　　【关键词】 Castleman病 滤泡性淋巴瘤 p63基因 p63蛋白 免疫组织化学 RT-PCR

　　Expression of p63 in Castleman disease and follicular lymphomas JIN Zhen-lin*，YU Kang，YANG Kai-yan，HUANG Ka-te. *Department of Hematology and Pathology，the Frist Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou，325000

　　Abstract: Objective: To investigate the expression of p63 protein and p63 mRNA in Castleman disease (CD) and follicular lymphomas(FL). Methods: p63 peotein expresstion was detected in 26 cases of Castleman disease (CD) and 18 cases of follicular lymphomas (FL) with immunohistochemistry.And reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to observe p63 isoforms expression (TAp63 andΔNp63). Twenty cases of reactive hyperplasia lymphoid (RHL) tissues were used as controls. Results: p63 protein expression was shown in 4 cases of 26 CD， 10 cases of 18 FL and 2 cases of 20 in RHL with immunochemistry. The expression rate of p63 protein in FL was significantly higher than that in CD and RHL (P <0.05)，the expression rates of p63 protein were same in CD and RHL(P >0.05). Conclusion: p63 gene may act as an oncogene in the development of FL，its effect on the development of CD is not primary.

　　Key words: Castleman disease;follicular lymphomas;gene，p63;immunohistochemistry;RT-PCR

　　p63基因是近几年发现的p53基因家族成员之一，对于原发肿瘤及细胞株的研究显示，p63在上皮组织肿瘤的发生、发展中可能起了一定作用[1-3]。如在食管、头颈、肺等部位的鳞状细胞癌中，p63的表达是增加的，而其在淋巴组织发生、发展中的作用仍未阐明。而Castleman病(Castleman disease，CD)及滤泡性淋巴瘤(follicular lymphoma，FL)作为淋巴组织肿瘤，在国内发病率不高，研究不多，因此我们检测了p63蛋白及p63基因亚型(TAp63及ΔNp63)在CD及FL中的表达，并初步探讨了两者间的关系。

　　1 材料和方法

　　1.1 标本来源 所有标本均来自2002-2008年期间来我院就诊，经病理组织形态学及免疫组化确诊为CD及FL患者的石蜡包埋组织。其中CD共26例，男7例，女19例，年龄18～79岁，中位年龄38.8岁。FL共18例，男10例，女8例，年龄35～64岁，中位年龄45岁。20例反应性增生性淋巴结炎(reactive hyperplasia lymphoid，RHL)作为对照。

　　1.2 试剂来源 一抗(p63 蛋白抗体)、二抗(通用型二抗)、磷酸盐缓冲夜、枸橼酸盐缓冲液、DAB显色试剂盒等购于北京中杉金桥生物公司，蛋白酶K为德国默克公司产品，Trizol试剂(invitrogen公司产品)，逆转录试剂盒及2×PCR Master Mix试剂均为Fermentas公司产品(产品号为K1622和K1171)。引物由上海基康生物公司合成。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 免疫组化：蜡块按常规切片(4μm)，脱蜡，微波抗原修复后用一抗4 ℃孵育过夜，再用二抗37 ℃孵育30 min，DAB显色，并用苏木精复染。染色后，阳性细胞棕黄色颗粒位于细胞核。设阳性和阴性对照，用已知阳性标本作阳性对照(乳腺癌)，用PBS代替一抗作阴性对照。在高倍镜下选10个具有代表性的视野，计算1 000个肿瘤细胞中阳性细胞数并换算成百分比。对照组的RHL计数淋巴细胞。参照Watanabe等[4]免疫组化评分标准：阳性细胞百分数<5%，未被染色为阴性(0分);5%～20%，浅棕色为弱阳性(1分);20%～50%，棕色为阳性(2分);50%～75%，深棕色为强阳性(3分);>75%，棕褐色为非常强阳性(4分)。将染色强度“0、1”合计为阴性，“2、3、4”合计为阳性。

　　1.3.2 逆转录聚合酶链反应技术(RT-PCR)：RNA的提取方法参照肖一红[5]和孟青等[6]并作适当调整。RNA提取后用紫外分光光度计进行定量，计算吸光度A260和A280比值来检测纯度，比值均大于1.8。

　　先将RNA逆转录成cDNA，操作严格按逆转录试剂盒说明书进行(逆转录成的cDNA可于-20 ℃保存)，然后用cDNA产物进行PCR扩增。PCR反应参照Di Como等[7]合成两对引物，序列分别为:TAp63上游引物: 5’-GTCCCAGAGCACACAGACAA- 3’和下游引物: 5’-GAGGAGCCGTTCTGAATCTG-3’，产物长度为267 bp;ΔNp63上游引物：5’-CTGGA AAACAATGCCCAGAC-3’，下游引物：5’-GGGTGA TGGAGAGAGAGCAT-3’，产物长度为198 bp;β-actin作为内参，引物序列为上游引物：5’-ATCATGTTTGA GACCTTCAACA-3’，下游引物：5’-CATCTCTTGC TCGAAGTCCA-3’，产物长度为318 bp。反应体系为50μL：包括2μL cDNA，上、下游引物各1μL， 25μL 2×PCR MIX，并加去核酸水至50μL。TAp63和ΔNp63扩增条件均为:先94 ℃变性5 min;然后94 ℃变性30 s，57 ℃退火40 s， 72 ℃延伸30 s，循环40次;最后72 ℃ 10 min。反应结束后将p63和β-actin的RT-PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果并拍照。

　　1.4 统计学处理方法 采用x2检验。

　　2 结果

　　2.1 免疫组化结果 作为对照的RHL，偶见染色阳性细胞位于淋巴结的生发中心，仅有2例表达阳性。26例CD，仅有4例(占15.4%)表达阳性，染色少而弱。而在FL，肿瘤性滤泡内有少至大量的肿瘤细胞染色阳性。p63蛋白在FL中的阳性表达率明显大于CD和RHL(P <0.05)，而p63蛋白在CD和RHL中的阳性表达率差异无显著性(P >0.05)(见表1及图1)。

　　2.2 RT-PCR结果 所有标本均未见ΔNp63的表达，而阳性表达的均为TAp63。20例RHL、26例CD及18例FL中，β-actin均有表达。TAp63在FL中的阳性率明显大于CD和RHL(P <0.05)，而TAp63在CD和RHL中的阳性率差异无显著性(P >0.05)(见表1及图2)。

　　3 讨论

　　p63基因于1998年由Schmale等[8]首先报道，定位于染色体3q27～3q29，与p53基因在结构和功能上具有很高的同源性，具有与p53同源的DNA结合域[9-10]，因此被归类为p53家族成员。p63基因包含15个外显子，在两个不同的启动子控制下，编码两类转录产物：一类为包含转录激活区的全长型p63(TAp63，包括3种异构体亚型：TAp63α、TAp63β和TAp63γ);另一类为缺乏酸性-N端反式激活区的截短型p63(ΔNp63，包括3种异构体亚型：ΔNp63α、ΔNp63β和ΔNp63γ)。TAp63 可与经典p53DNA结合位点结合，诱导细胞凋亡;ΔNp63不具有转录激活活性，以显性失活的方式抑制TAp63和p53依赖的靶基因的转录，不诱导凋亡[11]。

　　最初认为p63是一种肿瘤抑制基因，并且其突变可能致肿瘤发生，因为抑癌基因的一个重要失活机制就是在基因的编码区发生碱基突变，从而失去抗肿瘤的功能[12-15]。然而大量研究已证实p63很少在肿瘤中突变[16]，Osada等[17]检测了66例原发肿瘤，只有1例肺未分化鳞状细胞癌发生点突变。实验证明p63基因缺失的小鼠没表现出易患肿瘤的倾向，而是表现为外胚层发育障碍[18]。因此目前还缺乏足够的证据确定p63为抑癌基因，p63在肿瘤中更多地表现为表达异常而不是基因突变。

　　在我们的实验中，我们通过RT-PCR检测了TAp63和ΔNp63两种亚型在FL及CD、RHL中的表达情况，结果发现阳性表达的为TAp63亚型，而另一亚型ΔNp63在三组疾病中均无表达，这与Pruneri G等[19-22]的研究结果一致。他们通过免疫组化或RT-PCR等方法检测了B细胞淋巴瘤(包括FL及其细胞株)，结果发现阳性表达的均为TAp63，而ΔNp63无一例表达。Di Como等[7]通过RT-PCR研究了2例正常淋巴结和6例B细胞淋巴瘤(包括3例FL和3例弥漫大B细胞淋巴瘤)，结果仅2例FL中能检测到ΔNp63的表达(其中1例表达非常微弱)，而8例有能检测到的TAp63亚型的表达。同时我们的实验发现p63蛋白在FL中的阳性率(10/18，55.6%)要显著高于在RHL(2/20，10%)和CD(4/26，15.4%)中的阳性率(P <0.05)，而p63蛋白在CD及RHL中的阳性表达率无差别(P >0.05)。这一点与Di Como等[7，19，23]的研究结果接近。并且Fukushima 等[21，7，19]发现，在FL中，p63蛋白的阳性率随着病理分级的增加而增加。

　　通过我们的实验结合Fukushima等[21，7，19]的研究，我们认为在FL、CD、RHL中，TAp63为主要的表达亚型，而p63在FL中的阳性率要明显高于CD和RHL，并随着肿瘤恶性程度的增加而升高，因而推测p63可能作为癌基因参与了FL的发生。左学兰等[24]研究发现，p63在B-NHL瘤细胞中过度表达，且p63与AI和PI显著正相关，因而推测p63可能通过影响细胞增殖和凋亡参与了肿瘤的发生。也有学者认为，在肿瘤发生、发展的过程中，由于其他抑癌基因的失活(特别是p53基因)，p63基因可能存在代偿性的表达增加。而Yang等[25]发现在某些弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCLS)中p63位于靠近染色体异位突变点的位置，因而推测在这些区域的基因组不稳定性可能导致了p63基因表达失调。Park等[23]发现，p53很少在p63阳性的恶性淋巴瘤(包括FL)中表达，Ribeiro-Silva等[26]研究发现，在乳腺癌中p63几乎不与p53同时表达，因而推测p63通过抑制p53基因的功能而起到致癌基因的作用。CD作为淋巴组织交界性肿瘤，我们实验中并未发现p63在CD中的阳性率较良性病变升高，因而我们推测p63可能在CD的发生中并不起主要作用，当然这仍需要进一步的大样本量的实验来证实。

　　由于p63多种异构体的存在及其在组织、器官及其肿瘤中呈选择性的表达，因此深入研究p63基因的转录剪切机制、各种异构体的表达情况及其在细胞周期和肿瘤发生中的作用、p63与p53及其他相关分子的相互作用，必将加深人们对肿瘤发病机制的理解。此外，对于p63表达的检测将有助于某些肿瘤的鉴别诊断、某些肿瘤良恶以及分化程度的诊断。

　　【参考文献】

　　[1] Mills AA, Zheng B, Wang XJ, et al. p63 is a p53 homologuerequired for limb and epidermalmorphogenesis[J]. Nature,1999,398(6729):708-713.

　　[2] Yang A, Schweitzer R, Sun D,et al. p63 is essential for regen-erative proliferation in limb, craniofacial, and epithelialdevelopment[J].Nature,1999,398(6729):714-718.

　　[3] Levrero M, De Laurenzi V, Costanzo A, et al. The p53/p63/p73 family of transcription factors: overlapping and dis-tinct functions[J]. J Cell Sci,2000,113(pt 10):1661-670.

　　[4] Watanabe H, Kanzaki H, Narukawa S, et al. Bcl-2 and Fasexpression in eutopic and ectopic human endometrium dur-ing the menstrual cycle in relation to endometrial cellapoptosis[J]. Am J Obstet Gynecol, 1997,176(2):360-368.

　　[5] 肖一红,尹训南,仇华吉,等.用套式PCR技术检测石蜡包埋组织中的猪瘟病毒RNA[J].中国预防兽医学报,2007,29(5):389-393.

　　[6] 孟青,杨文秀, 胡军,等.石蜡包埋组织中RNA提取方法的改进和完善[J].贵阳医学院学报,2005,30(3):241-243.

　　[7] Di Como CJ,Urist MJ,Babayan I,et al. p63 expression pro-files in human normal and tumor tissues[J].Clin Cancer Res,2002,8(2):494-501.

　　[8] Schmale H,Bamberger C. A novel protein with strong ho-mology to t he tumor suppressor p53[J]. Oncogene,1997,15(11):1363-1367.

　　[9] Kaelin WG Jr. The p53 gene family[J]. Oncogene, 1999,18(53):7701-7705.

　　[10] Strano S, Rossi M, Fontemaggi G, et al. From p63 to p53across p73[J]. FEBS Lett, 2001, 490(3):163-170.

　　[11] Benard J,Douc-Rasy S,Ahomadegbe JC,et al. TP53 familymembers and human cancers[J ]. Hum Mutat,2003,21(3):182-191.

　　[12] Hollstein M,Sidransky D,Vogelstein B,et al. p53 mutationsin human cancers[J].Science 1991,253(5015):49-53.

　　[13] Greenblatt MS,Bennett WP,Hollstein M,et al. Mutations inthe p53 tumor suppressor gene:clues to cancer etiology andmolecular pathogenesis[J]. Cancer Res,1994,54(18):4855-4878.

　　[14] Kaghad M,Bonnet H,Yang A,et al.Monoallelically expressedgene related to p53 at 1p36,a regeion frequently deleted inneuroblastoma and other human cancers[J].Cell,1997,90(4):809-819.

　　[15] Hainaut P,Hernandez C,Robinson A,et al. IARC database ofp53 gene mutations in human tumors and cell lines:updatedcompilation,revised formats and new visualisation tools[J].Nucleic Acid Res,1998,26(1):205-213.

　　[16] Park BJ, Lee SJ, Kim JI, et al. Frequent alteration of p63expression in human p rimary bladder carcinomas[J]. Can-cer Res, 2000, 60(13):3370-3374.

　　[17] Osada M,Ohba M,Kawahara C,et al.Cloning and functionalanalysis of human p51,which structurally and functionallyresembles p53[J].Nat,Med,1998,4(7):839-843.

　　[18] Mills AA, Zheng B, Wang XJ, et al. p63 is a p53 homologuerequired for limb and epidermal morphogenesis[ J ]. Nature,1999,398(6729):708-713.

　　[19] Pruneri G, Fabris S, Dell'Orto P, et al. The transactivatingisoforms of p63 are overexpressed in high-grade follicularlymphomas independent of the occurrence of p63 geneamplification[J]. J Pathol, 2005,206(3):337-345.

　　[20] Nylander K, Vojtesek B, Nenutil R, et al. Differential ex-pression of p63 isoforms in normal tissues and neoplasticcells[J]. J Pathol,2002,198(4):417-427.

　　[21] Fukushima N,Satoh T,Sueoka N,et al. Clinico-pathologicalcharacteristics of p63 expression in B-cell lymphoma[J].Cancer Sci,2006,97(10):1050-1055.

　　[22] Hedvat CV,Teruya-Feldstein J,Puig P,et al. Expression ofp63 in diffuse large B-cell lymphoma[J].Appl ImmunohistochemMol Morphol, 2005, 13(3):237-242.

　　[23] Park CK,Oh YH. Expression of p63 in reactive hyperplasiasand malignant lymphomas[J].J Korean Med Sci ,2005,20(5):752-8.

　　[24] 左学兰,周颖,周新,等.存活蛋白和P63蛋白在B 细胞非霍奇金淋巴瘤组织中的表达及其对细胞凋亡和增殖的作用[J].中国实验血液学杂志,2007,15 (1) : 99-102.

　　[25] Yang A, KaghadM, Wang Y, et al. p63, a p53 homolog at3q27-29, encodes multiple products with transactivating,death-inducing, and dominant-negative activities[J]. MolCell,1998,2(3):305-316.

　　[26] Ribeiro-Silva A , Zambelli Ramalho LN , Britto Garcia S, et al.The relationship between p63 and p53 expression in nor-mal and neoplastic breast tissue[J]. Arch Pathol Lab Med,2003,127(3):336-340.