野生型PTEN基因对人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226增殖、凋亡和侵袭活性的影响

　　作者：王素云 成志勇 邓 凯1 陈 浩 姚 丽 杨静慈 尚银涛 潘 崚 作者单位：(河北医科大学第二医院血液内科血液实验室，河北 石家庄 050000)

　　【摘要】 目的 探讨外源性野生型PTEN基因对人多发性骨髓瘤(MM)细胞株RPMI8226增殖、凋亡、侵袭活性的影响以及PTEN/FAK信号传导通路在细胞侵袭活性中的作用。方法 将携带人野生型PTEN及绿色荧光蛋白的腺病毒(AdPTENGFP)及空载体腺病毒(AdGFP)体外转染至RPMI8226细胞。通过MTT法检测细胞生长曲线，Hoechst33342染色检测细胞凋亡，荧光定量PCR(FQPCR)检测PTEN及FAK mRNA水平变化，Western印迹检测PTEN、FAK及pFAK蛋白变化，Transwell小室检测RPMI8226细胞侵袭能力。结果 AdPTENGFP以感染复数为100转染RPMI8226细胞后，第4天达到最大生长抑制率为42.01%，AdPTENGFP转染RPMI 8226细胞72 h后细胞凋亡率为(35.02±6.80)%，PTEN mRNA及蛋白表达升高，FAK mRNA以及FAK、pFAK蛋白表达下调，与AdGFP组相比差异显著(P<0.01，P<0.05);Transwell小室结果显示，转染AdPTENGFP组漏入下室内及黏附于下室面细胞数量较AdGFP组显著减少(P<0.01)。结论 转染野生型PTEN基因的RPMI8226细胞增殖受抑，凋亡增加，细胞侵袭力明显减弱，其作用可能与下调FAK、pFAK表达有关。

　　【关键词】 PTEN基因;多发性骨髓瘤;增殖;凋亡;侵袭

　　目前认为遗传学变异是多发性骨髓瘤(MM)的重要致病因素，抑癌基因的缺失是重要的遗传学变化，但对MM基因学改变还知之甚少。PTEN基因是迄今为止发现的第一个具有双重磷酸酶活性的肿瘤抑制基因〔1〕。PTEN表达水平与多种血液系统恶性肿瘤密切相关〔2，3〕，幼年型粒单核细胞白血病(juvenile myelomonocytic leukemia，JMML)病人常见PTEN缺失〔4〕，强力提示PTEN在调节造血细胞增殖、凋亡、恶性转化中的作用。PTEN通过负调控多种信号传导途径，来调节细胞周期进展、细胞凋亡和肿瘤细胞迁移和侵袭。其中PTEN/FAK信号传导通路在影响细胞的增殖、凋亡、侵袭等生物学行为方面起着重要作用。既往尚无资料显示PTEN是否能够影响MM细胞的增殖和侵袭。因此，我们将重组腺病毒介导的野生型PTEN基因导入人MM细胞株RPMI8226，使PTEN基因在RPMI8226细胞中高表达，观察其对RPMI8226细胞增殖、凋亡和侵袭活性的影响，研究PTEN/FAK的表达水平，以进一步了解MM发生发展中可能存在的分子机制，为探索MM基因治疗提供新思路。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 重组腺病毒AdPTENGFP和AdGFP由上海吉凯生物公司合成并鉴定，在293A细胞中进行扩增及滴度测定。人MM细胞株RPMI8226细胞和人胚肾细胞系293A细胞均为本实验室长期保存细胞系。RPMI8226细胞用含15%胎牛血清(杭州四季青)RPMI 1640培养基培养，293A细胞用含10%胎牛血清RPMI 1640培养基培养，均在37℃、5%CO2，饱和湿度环境孵育。

　　1.2 病毒转染及效率的测定 将100 μl含病毒液的无血清培养液加入RPMI8226细胞中，感染复数(Multiplicity of infection，MOI)为100，在37℃，5% CO2条件下培养2 h，置于含15%胎牛血清RPMI 1640培养液继续培养。流式细胞仪计算转染效率。

　　1.3 MTT法测定细胞抑制率 取对数生长期RPMI8226细胞，分为对照组、转染AdGFP组、转染AdPTENGFP组，以1×104个/孔接种于96孔板培养，每组3个复孔，实验重复三次，每孔200 μl。按MOI=100转染细胞，于不同时间点每孔加入MTT溶液，孵育4 h后离心弃上清，另加入二甲基亚砜(DMSO)振荡数分钟，选择OD490 nm波长，在酶标仪上测定各孔的吸光度A值。抑制率=(对照组A-试验组A)/对照组A×100%。

　　1.4 细胞凋亡率检测 Hoechst33342染色检测细胞凋亡：分别收集转染后不同时间不同组的RPMI8226细胞，取100 μl细胞悬液，加入荧光染料Hoechst33342至终浓度为10 μg/mL。常温避光染色15 min，取40 μl细胞悬液，在激发波长为350 nm荧光显微镜下观察结果并计数10个视野(200个细胞/视野)，计算凋亡细胞所占比例。

　　1.5 实时荧光定量PCR检测PTEN、FAK基因表达 分组收集转染后3 d RPMI8226细胞，Trizol提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA。实时荧光定量PCR反应：SYBR反应体系共25 μl。反应条件为94℃ 5 min，94℃ 45 s，60℃ 1 min，30个循环，设空白对照，记录循环阈值(Ct值)。根据△Ct= Ct目的基因Ct βactin，△△Ct=2-△Ct计算目的基因与βactin相对表达量。PCR引物由北京赛百盛生物公司合成，检测基因序列见表1。

　　1.6 Western印迹检测PTEN、FAK、pFAK蛋白表达 分组收集转染3 d后RPMI8226细胞，每组收集1×107个细胞，加入200 μl预冷的蛋白裂解液4℃裂解1 h，冰浴下超声裂解15 min。12 000 r/min 4℃离心20 min，取上清，用考马斯亮蓝试剂盒测定蛋白浓度，分装后20℃保存。取80 μg样品蛋白加入等体积上样缓冲液，经SDSPAGE凝胶电泳后，用水浴式电转仪转至硝酸纤维素膜上。经5%BSA 37℃封闭1 h，加入1∶500稀释的小鼠抗人单克隆抗体，4℃培育过夜。TBS漂洗5 min×3次，加入山羊抗小鼠HRP标记二抗，37℃孵育1 h，TBS漂洗5 min×3次。化学发光法检测后分析结果。表1 FQPCR扩增引物序列

　　1.7 Transwell小室试验检测细胞侵袭力 将50 mg/L Matrigel胶4℃融化，用无血清RPMI1640培养基将其1∶8稀释混匀。200 μl包被Transwell小室聚碳酸脂膜上室面，4℃风干备用。将不同转染组细胞加入无血清培养基孵育12 h。取105细胞加入800 μl无血清培养基中，加入1 g/L BSA维持渗透压，放入Transwell小室上层。下室加入含10%FBS RPMI1640培养基1 000 μl，在37℃、5% CO2环境下培养孵育24 h。取出小室，用下室培养液反复淋洗下室底面，用棉签擦去多聚碳酸盐膜上层细胞，立刻在倒置荧光显微镜下观察穿膜及黏附在小室下层有荧光的细胞数量，400倍显微镜下计数10个视野取平均值，以穿膜细胞数目多少作为评价其侵袭力强弱的指标。将脱落及淋洗下来的细胞在倒置显微镜下计数荧光细胞数。整个操作过程于冰上及无菌条件下，并重复3次。

　　1.8 统计学方法 数据以x±s表示，两样本均数比较应用t检验，多样本均数比较应用方差分析，率的比较采用χ2检验。

　　2 结 果

　　2.1 重组腺病毒的转染效率 当MOI为100时，流式细胞仪检测表达绿色荧光蛋白的细胞的比例，腺病毒感染RPMI8226细胞效率为(83.1±6.4)%，符合基因治疗对载体的要求。

　　2.2 MTT试验检测细胞增殖 在MOI为100时，RPMI 8226细胞转染AdPTENGFP后第2～6天出现差异，7 d以后细胞荧光衰减，细胞生长抑制逐渐降低，第4天细胞生长抑制率最大，为42.01%，AdGFP与AdPTENGFP组OD 490值比较有统计学意义(P<0.01)，见表2。表2 转染后不同时间点RPMI8226细胞A490抑制率

　　2.3 细胞凋亡率变化 Hoechst33342染色检测凋亡，正常细胞核Hoechst33342着色形态呈圆形，淡蓝色;而凋亡细胞核由于浓集而呈亮蓝色或核呈分叶，碎片状，边集(见图1)。PTEN基因转染RPMI 8226细胞72 h后各组细胞凋亡率分别为：未转染组(4.56±2.02)%，AdGFP组(5.51±2.43)%，AdPTENGFP组(35.02±6.80)%，AdPTENGFP组与未转染组和AdGFP组相比差异显著(P<0.01)。

　　2.4 转染后3 d PTEN基因及蛋白表达水平 转染AdPTENGFP组PTEN mRNA(18.37±7.05)表达水平明显高于AdGFP组(1.65±0.37)及未转染对照组(1.77±0.42)(P<0.01)。转染AdPTENGFP组蛋白表达水平(1.43倍)明显高于未转染组(0.73倍)及AdGFP(0.78倍)(P<0.01)(图2)。

　　2.5 转染PTEN后FAK mRNA及FAK、pFAK蛋白表达水平 转染AdPTENGFP后，AdPTENGFP组FAK mRNA(0.54±A： AdGFP组(×100);B：AdPTENGFP组(×100);C： 转染AdPTENGFP细胞(×400);D： 与C同一视野下Hochest染色显示转染AdPTENGFP细胞已经凋亡(×400)

　　图1 转染RPMI8226细胞后第3天Hoechst33342染色检测凋亡

　　0.12)表达水平明显低于AdGFP组(1.64±0.30)及未转染对照组(1.59±0.38)(P<0.01)。FAK蛋白检测显示转染AdPTENGFP组(0.73倍)低于未转染组(1.18倍)及AdGFP(1.14倍)(P<0.05)，而pFAK表达水平在AdPTENGFP组(0.07倍)明显低于未转染组(0.29倍)及AdGFP(0.30倍)(P<0.01)，见图2。

　　2.6 细胞侵袭能力的检测 MOI=100时，RPMI8226细胞转染AdPTENGFP穿透ECM膜的数目明显少于其他对照组。AdGFP组和AdPTENGFP组漏出细胞总量分别为618±73和389±52(P<0.05)，下室漏出具有荧光细胞的数量分别98±13和41±5(P<0.01)，下室面细胞数量分别为51±17和18±8(P<0.01)，证实AdPTENGFP的细胞侵袭力明显弱于AdGFP。见图3。

　　3 讨 论

　　研究表明，PTEN蛋白对造血干细胞的活化、分化起重要调控作用，并能阻止白血病的发生〔5〕。目前普遍使用的肿瘤基因治疗方法是通过导入外源性野生型抑癌基因补充或替代突变的抑癌基因。既往我们成功地将以腺病毒为载体的野生型PTEN转染慢性粒细胞白血病(CML)急变细胞系K562细胞，证实PTEN基因可以抑制K562细胞增殖、凋亡〔6〕。本次结果与我们前次实验结果一致〔6〕，表明PTEN过表达能够发挥其负调控作用抑制RPMI8226细胞的增殖和诱导瘤细胞凋亡。

　　PTEN基因表达产物发挥双特异性磷酸酶活性，不仅抑制细胞增殖，而且使细胞转移能力减弱〔7〕。PTEN通过直接或间接的作用，整合复杂的信号网络系统〔8〕。FAK为非受体酪氨酸激酶，其功能是控制细胞的黏附、运动和存活，其活化与细胞的癌变和恶性进展程度等密切相关，可促进细胞的侵袭和转移，抑制FAK会导致细胞失巢性凋亡。PTEN能作为蛋白质磷酸酶，影响FAK磷酸化，调节细胞的运动、黏附及迁移等多项生物功能，来降低肿瘤的黏附能力〔9〕。本研究说明PTEN基因转染能够降低MM RPMI8226细胞的侵袭活性，并且影响相关基因和蛋白的表达，说明PTEN蛋白可以调节细胞内FAK磷酸化水平，从而影响细胞的迁移和侵袭能力，这可能是转染PTEN后RPMI8226细胞侵袭受到抑制的重要原因之一。本实验提示以PTEN为靶点的基因治疗的可行性，PTEN将有可能成为MM基因治疗的一种新的选择。

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