真性红细胞增多症患者骨髓CD34 + 细胞bcl-2蛋白的表达

　　作者：黄望香 罗玲 陈建霞 高清平

　　作者单位:518116广东深圳市龙岗中心医院内二科　　430070湖北武汉大学人民医院血液科

　　【摘要】 目的 研究真性红细胞增多症(真红)患者CD34 + 细胞bcl-2蛋白的表达，从而探讨真红的发病机制。 方法 用SABC免疫组化法及图像分析技术，检测真红患者及正常骨髓CD34 + 细胞中bcl-2蛋白的表达。结果 真红患者骨髓CD34 + 细胞bcl-2蛋白表达明显高于正常人(P<0.01)。 结论 真红患者骨髓CD34 + 细胞bcl-2蛋白高表达致CD34 + 细胞低凋亡可能是真红的发病机制之一。

　　关键词 真性红细胞增多症 造血干细胞 骨髓 凋亡蛋白

　　Expression of bcl-2protein in CD34 + positive bone marrow cells of patients with polycythemia vera

　　Huang Wangxiang，Luo Ling，Chen Jianxia，et al.

　　Department of No.2Internal Medicine，Central Hospital of Longgang，Shenzhen518116.

　　【Abstract】 Objective To investigate the expression of bcl-2protein in CD34 + positive bone marrow cells of patients with polycythemia vera(PV).Methods The expressions of bcl-2protein in bone marrow CD34 + cells from20PV patients and11normal persons were assessed by SABC immunohistochemical staining with specific anti-bodies and photography analysis technique.Results The expression of bcl-2in CD34 + bone marrow cells of PV pa-tients was significantly higher than that of normal controls(P<0.01).Conclusion Over-expression bcl-2，one of anti-apoptosis genes in CD34 + bone marrow cells might be involved in the lower apoptosis of PV patients.

　　Key words polycythemia vera hematopoietic stem cell bone marrow apoptosis protein

　　真性红细胞增多症(真红)为发病率低，造血干/祖细胞有异常克隆性的造血系统疾病。临床表现以红细胞增多为主的两系或三系血细胞增多以及由此引起的血液黏滞表现。主要表现以多血症及其引起的栓塞。关于其发病机制目前尚不清楚，近来有资料认为其存在高增值性及低凋亡性的特点 [1] 。bcl-2蛋白家族是调节凋亡的关键因素，可抑制细胞凋亡，延长细胞寿命 [2] ，笔者采用SABC免疫组化法和图像分析技术，检测真性患者及正常骨髓CD34 + 细胞中bcl-2蛋白的表达情况，以期从凋亡的角度了解真红的发病机制。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料 2001～2004年于我院及武汉大学人民医院门诊及住院诊治的患者20例，全部患者的诊断及疗效判定依据国内统一标准 [3] ，其中男8例，女12例，年龄10～66岁，平均40岁，其中15例为初诊患者，2例单纯放血治疗，3例应用羟基脲(Hu)和干扰素治疗，平均治疗时间为7个月，停药2周以上且血常规仍高于正常。11名正常对照者为骨髓捐献者，男6例，女5例，平均36岁(27～45岁)。

　　1.2 主要试剂及仪器 MACS分选器及其试剂盒购自北京基因公司。CD34 + 免疫组化试剂盒，bcl-2免疫组化染色试剂盒均由武汉博士德公司提供。CMIAS系列多功能真彩图像分析仪由北京航空航天大学生产。

　　1.3 样品制备 无菌采集患者骨髓5ml及志愿献髓者骨髓2ml，ACD抗凝，经含5mmol/L的EDTA的PBS缓冲液1∶1稀释，Ficoll液(相对密度1.077)400g梯度离心25min，收集界面层单个细胞(MNS)，洗涤2次备用。

　　1.4 CD34 + 细胞的分离纯化 利用MACS分离CD34 + 细胞，分离步骤按说明书操作。将分离的细胞涂于多聚赖氨酸处理的印孔载玻片上，纯丙酮固定30min，干燥后置于-20℃冰箱保存备用。

　　1.5 CD34 + 细胞纯度检测 采用APAAP免疫组化法。

　　1.6 bcl-2蛋白表达的检测 采用SABC亲合细胞化学方法。以PBS代替一抗作为阴性对照。

　　1.7 吸光度(A)测定 采用CMIAS系列多功能真彩图像分析仪，在20倍物镜下，每张涂片随选50～100个bcl-2阳性细胞，经确定灰度后，测定阳性细胞的A值，20例真红患者和11名健康志愿者骨髓样品一同测定，进行组间统计分析。

　　2 结果

　　2.1 CD34 + 细胞的纯度鉴定 纯度达90%～95%。

　　2.2 bcl-2蛋白表达 bcl-2蛋白阳性产物多数在胞浆中呈弥漫性分布，部分呈团块状或颗粒状，有的出现于细胞膜及核膜上。阴性对照者未见阳性细胞。

　　2.3 bcl-2蛋白表达A值分析 真红患者组A值范围为0.1026～0.1878(0.1305±0.2050);正常组的A值范围为0.0868～0.1030(0.097±0.0150)。两组间比较，差异有非常显著性(P<0.01)。

　　3 讨论

　　真性红细胞增多症(polycythemia vera)是一种克隆性疾病，以红系细胞异常增多为主的慢性骨髓增生性疾病，其骨髓造血祖细胞对多种造血因子高度敏感，可以在不加外源性细胞因子的情况下产生内源性红系及巨核系集落。白洁等 [1] 应用双色流式细胞仪检测真红患者CD34 + 的凋亡及增殖情况，发现其存在低凋亡及高增殖特点。为了进一步研究其低凋亡的机制，笔者检测真红患者凋亡蛋白的bcl-2的表达。

　　目前，发现与细胞凋亡相关的基因有3类，即促进细胞凋亡的基因、抑制细胞凋亡的基因和在细胞凋亡过程中表达的基因。bcl-2是细胞凋亡抑制基因，定位于人染色体18q21，含3个外显子和2个内含子，全长约230kb，cDNA长约6kb，该基因表达产物是239个氨基酸组成的相对分子质量为25.8×10 3 的亲脂膜蛋白，主要定位于细胞核膜、线粒体膜与内质网膜。在造血组织中，主要分布于较原始的造血细胞，随细胞的分化成熟，其表达程度逐渐降低。bcl-2蛋白的生理主要是阻遏细胞凋亡，对细胞周期和细胞分化不产生影响，过量表达可抑制许多因素引起的细胞凋亡。

　　笔者的研究结果发现真红患者CD34 + 细胞bcl-2蛋白表达明显高于正常人，初步证明，某些致病因子侵入敏感机体后，引起抗凋亡蛋白bcl-2高表达，致使骨髓造血细胞凋亡减低，过度增殖。该发现提示，设法阻断bcl-2的表达，可成为治疗真红的新靶点。

　　参考文献

　　1 白洁，邵宗鸿.真性红细胞增多症造血干/祖细胞生物学特征的研究进展.中华内科杂志，2002，40:140-142.

　　2 Raff M.Cell suicide for beginners.Nature，1998，396:119-122.

　　3 张之南，沈悌.血液病诊断及疗效标准，第2版.北京:科学出版社，1998，141.