硼替佐米诱导ABCG2High耐药鼻咽癌细胞高表达NKG2D配体的实验研究

　　作者：黄宇贤，王 杨，胡亮杉，宋朝阳，郭坤元 作者单位：510282 广州，南方医科大学珠江医院血液科

　　【摘要】 目的 探讨硼替佐米诱导高表达ABCG2耐药鼻咽癌细胞对AlloNK细胞杀伤敏感性的机制。方法 利用免疫磁珠技术分离ABCG2High CNE2/DDP细胞及AlloNK细胞，流式细胞技术检测分离后细胞纯度及经硼替佐米处理前后靶细胞NKG2D配体表达率，LDH释放测定法检测经硼替佐米处理前后ABCG2HighCNE2/DDP细胞对AlloNK细胞的杀伤敏感性。结果 ABCG2HighCNE2/DDP细胞分离后ABCG2表达率为(91.40±2.32)%，分选后NK细胞CD3-CD16+CD56+细胞的纯度达90%以上。经硼替佐米处理之后靶细胞MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3表达率，由药物处理之前的(2.92±0.33) %、(4.27±0.33)%、(5.80±0.62)%、(11.10±3.15)%、(7.75±1.14)%分别上升到(17.52±2.04)%、(12.53±3.68)%、(15.24±2.91)%、(62.02±6.85)%、(35.69±3.23)%。在效靶比为10∶1、20∶1、AlloNK细胞对硼替佐米处理前后ABCG2HighCNE2/DDP细胞的杀伤率分别为(15.32±13.86)%、(27.26±6.81)%及(35.06±5.10)%、(52.34±4.78)%。处理前后杀伤率差异有统计学意义(F=26.03 ，P=0.000)。结论 硼替佐米通过诱导肿瘤细胞高表达NKG2D配体(MICA/B、ULBP13)，使肿瘤细胞对AlloNK细胞的杀伤敏感性增强。

　　【关键词】 硼替佐米; ABCG2; 同种异体自然杀伤细胞; NKG2D; 杀伤敏感性

　　Induction of Expression of Ligands for NKG2D Receptor in ABCG2High Nasopharyngeal Carcinoma by Bortezomib

　　HUANG Yuxian,WANG Yang,HU Liangshan,SONG Chaoyang,GUO Kunyuan

　　Department of Hematology,Zhujiang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510282,China

　　Corresponding Author: GUO Kunyuan,Email: gzyuan@pub.guangzhou.gd.cnAbstract：Objective To investigate the mechanism on the effects of improving cytotoxic sensitivity of ABCG2High CNE2/DDP cells to AlloNK cells which exerted by bortezomib.Methods ABCG2HighCNE2/DDP cells and AlloNK cells were isolated by magnetic activated cell sorting (MACS).Flow cytometry was used to evaluate the purity of isolated cells and the expression of NKG2Dligands on target cells before and after incubation with bortezomib.Subsequently,the cytotoxic sensitivity of treated and untreated ABCG2High CNE2/DDP cells to AlloNK cells were measured by LDH releasing assay.Results The expressions of ABCG2 in ABCG2High CNE2/DDP cells were (91.40±2.32)%.More than 90% of isolated NK cells showed tobe CD3-CD16+CD56+ cells which would definitely meet the needs of experiments.The expressions of MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3 on target cells incubated with bortezomib have respectively increased from (2.92±0.33)%,(4.27±0.33)%,(5.80±0.62)%,(11.10±3.15)%,(7.75±1.14)% to (17.52±2.04)%、(12.53±3.68)%、(15.24±2.91)%、(62.02±6.85) %、(35.69±3.23)%.At the E∶T ratio of 10∶1 and 20∶1,the cytotoxic sensitivity of ABCG2HighCNE2/DDP cells to AlloNK cells increased from (15.32±13.86)% and (27.26±6.81)% in untreated groups to (35.06±5.10)% and (52.34±4.78)% in bortezomib treated groups.Data above showed that cytotoxic sensitivity of target cells in each group before and after bortezomib treatment had significant differences (F=26.03 P=0.000).Conclusion Bortezomib can upregulate expressions of NKG2Dligands (MICA/B、ULBP13) in ABCG2High nasopharyngeal carcinoma cells,which resulted in higher cytotoxic sensitivity to AlloNK cells.

　　Key words：Bortezomib; ABCG2; AlloNK cell; NKG2D; Sensitivity cytotoxicity

　　硼替佐米(Bortezomib,PS341,VELCADE)，商品名为万珂，是一种剂量依赖的，可逆的蛋白酶体抑制剂，也是第一个应用于临床治疗的蛋白酶体抑制剂。它主要通过特异性阻断泛素蛋白酶体通路起作用，能够有效抑制多种肿瘤细胞生长、血管生成和迅速诱导细胞凋亡，不但对多发性骨髓瘤、淋巴瘤有良好的疗效，而且可以用于治疗多种实体瘤，如甲状腺癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌等[15]。最近研究资料显示，硼替佐米能增加肿瘤细胞对免疫治疗的敏感性，但其确切的机制尚不清楚。本文利用免疫磁珠技术分离ABCG2HighCNE2/DDP细胞和AlloNK细胞，流式细胞术检测用硼替佐米处理前、后靶细胞NKG2D配体表达率的变化，LDH释放法检测靶细胞对AlloNK细胞杀伤敏感性的变化，探讨硼替佐米诱导耐药鼻咽癌细胞对AlloNK细胞杀伤敏感性的变化及其机制，为AlloNK细胞过继性免疫化疗奠定理论基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料及器材

　　试剂：硼替佐米(西安杨森)，抗NKG2D配体(antiMICA/B单抗、antiULBP13单抗,BD公司)，PE标记羊抗鼠IgG1(eBioscience公司)，PE标记的鼠抗人ABCG2单抗(eBioscience公司)，抗CD56免疫磁珠、抗PE免疫磁珠(Miltenyi Biotec公司，德国)，杀伤活性检测试剂盒(Cytotox96 nonradioactive cytotoxocity assay，Promega公司)，胎牛血清(杭州四季青)，RPMI 1640(Gibco公司)。仪器：5810R高速低温离心机(Eppendorff 公司)、2010酶标仪(郑州赛博仪器公司)、Olympus倒置荧光显微镜(Olympus公司，日本)，二氧化碳培养箱(Thermo公司，美国)，Beckman Coulter EPICS AITRA型流式细胞仪(Beckman Coulter公司)，电子天平(CE公司，德国)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 高表达ABCG2 CNE2/DDP细胞和AlloNK细胞分离及表达率检测 (1)ABCG2HighCNE2/DDP细胞的分离纯化：收集CNE2/DDP细胞，PBS洗涤两次，计数细胞，重悬于PBS中。按细胞密度为1×106/ml加0.5μg PE标记的鼠抗人ABCG2单抗，4℃孵育30min。离心，弃上清，重悬，按细胞密度为1×107l/ml加入20μl antiPE免疫磁珠，作细胞阳性分选，流式细胞仪分析ABCG2HighCNE2/DDP纯度(高表达ABCG2的CNE2/DDP细胞记为ABCG2HighCNE2/DDP)。(2) AlloNK细胞的分离纯化：采用常规密度梯度离心法分离健康人外周血单个核细胞，PBS洗涤2次，计数细胞，CD56 MicroBeads作细胞阳性分选，获得CD3-CD56+细胞，流式细胞仪检测CD3-CD16+CD56+细胞的纯度。

　　1.2.2 细胞培养 含有10%胎牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素、3μmol/L DDP的RPMI 1640培养基，37℃、5%CO2常规培养，实验中所用细胞均处于对数生长期。培养NK细胞时加入1000u/ml的rhIL2。

　　1.2.3 流式细胞术分析经硼替佐米处理前后靶细胞NKG2D配体表达率 分别收集未经硼替佐米处理及经硼替佐米100ng/ml共孵育的ABCG2HighCNE2/DDP细胞，PBS洗涤2次，计数细胞，按细胞密度为1×106/100μl各加入2μg鼠抗人NKG2D配体(MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3)单抗，4℃孵育30min ，PBS洗涤两次，加入PE标记羊抗鼠单抗，同型IgG1(Pharmingen公司)作为阴性对照抗体，4℃孵育20min，PBS洗涤，用流式细胞仪分析样本中1×104个细胞中阳性细胞数，计算荧光标记阳性细胞的百分率，实验重复3次。

　　1.2.4 LDH释放测定法检测AlloNK细胞对经硼替佐米处理前后靶细胞杀伤活性 收集ABCG2HighCNE2/DDP细胞，分三组。处理组：硼替佐米100ng/ml共孵育4h的ABCG2HighCNE2/DDP细胞;未处理组：未经硼替佐米预处理的ABCG2HighCNE2/DDP细胞;对照组：K562细胞，用含5%的胎牛血清RPMI 1640完全培养液调整细胞密度为1×105/ml，加于96孔板中，每孔50μl。以新鲜分离AlloNK细胞为效应细胞，按不同效靶比(10∶1、20∶1)分别加入不同量的效应细胞各50μl。各组均设3个复孔，置37℃、5% CO2条件下共孵育4h后，离心，吸取50μl上清，加入96孔平底酶标板中，加入50μl LDH底物反应液，室温放置30min，每孔加50μl反应终止液。酶标仪上波长490nm处以空白组为基准测OD值。计算NK细胞杀伤活性(%)=(实验组OD值-靶细胞自然释放组OD值-效应细胞自然释放组OD值)÷(靶细胞最大释放组OD值靶细胞自然释放组OD值)×100%。

　　1.3 统计学方法

　　用SPSS13.0软件进行数据处理，数据以±s表示，药物处理前后靶细胞NKG2D配体表达率采用配对t检验，靶细胞对AlloNK细胞杀伤敏感性比较采用单因素方差分析，差异有统计学意义(P<0.05)。

　　2 结果

　　2.1 ABCG2HighCNE2/DDP细胞、AlloNK细胞分离纯度及表达率检测

　　流式细胞仪检测结果显示ABCG2HighCNE2/DDP细胞的ABCG2表达率为(91.40±2.32)%，其细胞异形性明显，见图1。分选后NK细胞镜下观察，细胞较小，呈圆形，细胞形态良好，流式细胞仪检测结果显示分选后CD3-CD16+CD56+细胞的纯度达90%以上,符合实验要求，见图2。

　　2.2 流式细胞术分析经硼替佐米处理前后靶细胞NKG2D配体表达率

　　流式细胞术分析结果显示：未经硼替佐米处理的ABCG2HighCNE2/DDP细胞NKG2D配体MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3表达率分别为(2.92±0.33)%、(4.27±0.33)%、(5.80±0.62)%、(11.10±3.15)%、(7.75±1.14)%，五种配体均弱表达或无表达;经硼替佐米处理后，NKG2D配体 MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3表达率明显升高，分别为(17.52±2.04)%、(12.53±3.68)%、(15.24±2.91)%、(62.02±6.85)%、(35.69±3.23)%，处理前后靶细胞NKG2D配体表达率进行配体t检验差异有统计学意义(t=11.38，P=0.008;t=8.39，P=0.05;t=9.03，P=0.05;t=13.85，P=0.005;t=12.17，P=0.006)，见图3。

　　2.3 LDH释放测定法检测AlloNK细胞对硼替佐米处理前后靶细胞杀伤活性

　　LDH释放测定法结果显示：AlloNK细胞对ABCG2HighCNE2/DDP细胞及K562细胞的杀伤活性随着效靶比升高而增强，靶细胞预处理前，效靶比为10∶1时，杀伤率分别为(15.32±13.86)%、(36.41±4.01)%;效靶比为20∶1时，杀伤率上升到(27.26±6.81)%、(52.33±5.49) %;说明AlloNK细胞具有正常杀伤能力。靶细胞经硼替佐米处理后，在效靶比为10∶1、20∶1时，杀伤率由处理前的(15.32±13.86)%、(27.26±6.81)%上升到(35.06±5.10)%、(52.34±4.78)%，另外，靶细胞预处理后，对AlloNK细胞杀伤敏感性与K562对照细胞杀伤敏感性持平。在这两种效靶比时，各组靶细胞的杀伤敏感性差异有统计学意义(F=26.03，P=0.000)，见图4。

　　3 讨论

　　ABCG2是新近发现的耐药相关蛋白，属于ATP结合盒式(ATPbinding cassette,ABC)转运蛋白家族的G亚家族成员。ABCG2介导的多药耐药是非典型的多药耐药(multidrug resistance,MDR)，对米托蒽醌、柔红霉素、拓扑替康、SN38、依利替康等药物交叉耐药，而对Pgp、MRP介导的MDR作用底物顺铂、长春新碱、紫衫醇不产生交叉耐药[6]。另外，有部分学者认为ABCG2专一表达于SP细胞，可能是干细胞的潜在标志[7]。对于这一类多药耐药肿瘤细胞，传统的治疗方法未能取得满意的疗效，这可能与肿瘤耐药发生机制的复杂性有关，因此对高表达ABCG2耐药鼻咽癌的辅助治疗需要联合其他治疗方法或另辟其径。

　　近年来的研究资料表明，NK细胞具有广泛抗肿瘤作用，包括体外对多种肿瘤细胞系(急、慢性白血病，淋巴瘤，骨髓瘤，黑色素瘤，前列腺癌，乳腺癌)具有杀伤活性，并且在动物移植瘤模型中表现出良好的抑瘤活性[89]。NK细胞发挥功能主要依赖NK细胞表面受体与多种表达MHC或非MHC类配体的细胞结合，传递抑制性或活化性信号，调节NK细胞的活性;而NK细胞活化性信号通路(NKG2DDAP10)介导杀伤活性强于杀伤细胞免疫球蛋白样受体(Killer cell immunoglobulinlike receptor，KIR)与MHCI类结合后形成的抑制性信号[1011]。另外，体外干预因素如细胞因子(IL2、IL15、IL18)、抗肿瘤分子靶向药物(Iressa、Glivec)等能调节NK细胞与靶细胞活化性配受体的表达，从而提高NK细胞杀伤活性或提高肿瘤细胞对NK细胞的杀伤敏感性[1214]。本研究中，靶细胞未经硼替佐米处理前，靶细胞五种NKG2D配体弱表达或无表达，其杀伤敏感性也较低。经硼替佐米处理后，ABCG2HighCNE2/DDP细胞五种NKG2D配体表达率比药物处理之前的明显上升，表明硼替佐米能诱导NKG2D配体，随着药物处理后靶细胞NKG2D配体表达率的升高，AlloNK细胞对靶细胞的杀伤活性比药物处理之前明显增强。在分析AlloNK细胞对靶细胞的杀伤活性时，学者们习惯用K562细胞作为NK细胞杀伤活性检测的对照细胞，主要是因为它是NK细胞杀伤的敏感细胞株，不表达抑制性信号，而高表达NK细胞活化性信号的NKG2D配体[8]，作者同样利用K562细胞作为对照细胞来检测NK细胞杀伤活性。

　　硼替佐米是一种对26S蛋白酶体具有高度特异性抑制能力的二肽基硼酸化合物，它通过抑制蛋白酶体20S催化中心的活性，从而选择性抑制体内某些具有重要调控作用的蛋白质的降解，进一步使细胞分裂停滞在G2/M期，导致细胞发生凋亡[1516]。最近研究也证实硼替佐米能有效降低化疗药物诱导凋亡的阈值，并能逆转耐药，同时消除细胞黏附介导所致的耐药，从而使肿瘤细胞对化学治疗、放射治疗更敏感;另外，ValésGómez M认为硼替佐米可以诱导肿瘤细胞表达免疫效应细胞活化性配体(MICA/B、ULBPS)，增加肿瘤细胞免疫治疗敏感性[17]。从上述的实验结果也验证了硼替佐米能选择性诱导肿瘤细胞NKG2D配体的表达，从而使肿瘤细胞对NK细胞的杀伤敏感性增强，但硼替佐米具体通过什么机制诱导靶细胞高表达NKG2D配体仍有待进一步研究。

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