不同途径输注造血干细胞对小鼠移植效果的比较

作者：蔡耘，黄绍良，黄科，陈惠芹，张绪超   

作者单位：中山大学附属第二医院儿科， 广州 510120

 【关键词】  骨髓腔内输注移植

    Comparison of  Efficacies of Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantations between Different Routes of Administration in Mice

    CAI Yun*, HUANG ShaoLiang, HUANG Ke, CHEN HuiQin, ZHANG XuChao

    Department of Pediatrics, The Second Affiliated Hospital, SUN YatSen University, Guangzhou 510120, China

    Abstract    When hematopoietic stem cells（HSCs）were administrated by intravenous infusion (IV) , most of them were trapped in some nonhematopoietic organs as like lungs that had abundant blood capillaries. Only a small fraction of injected cells could home to the bone marrow, which reduced the engraftment of HSCs. The purpose of intrabone marrow (IBM) transplantation was to facilitate the homing of HSCs directly. Based on the established murine model for allogeneic umbilical cord blood transplantation (UCBT) by IBM injection, the objective of this study was to compare the distribution of fetal and neonatal peripheral blood (FNPB)  mononuclear   cells (MNC)  in vivo and the efficacy of HSCT by different routes of administration in mice. BALB/c recipient mice exposed to  sublethal dose 60Co γray  were transplanted with FNPBMNCs from Ｃ57BL/6 mice. Recipient mice were divided into six groups at random: unilateralIBM group; bilateralIBM group; IV group; bilateralIBM+IV group; irradiated control group and normal group. The distribution of CFSElabeled FNPBMNCs in the recipients was observed in frozen sections of different organs or by flow cytometry. The survival rate, engraftment level, recovery of hematopoietic function and GVHD of recipient mice were studied. The results showed that infused by IBM route, FNPBMNCs mainly accumulated in the bone marrow (BM) cavity of the injected side tibia. Some of them could enter the BM of noninjected bones via blood circulation and few were trapped in the lung. Though same amount of FNPBMNCs  were injected into recipient mice of unilateral and bilateralIBM group, less cells could leak into peripheral blood or other tissues when transplanted by bilateralIBM route. Therefore, in term of  accelerating hemopoietic recovery, the injection of IBM route was better than IV route, especially bilateral IBM injection of HSCs, which neared the normal level of peripheral blood cells and colonyforming units of bone marrow nucleated cells at day 21  after transplantation, followed by unilateralIBM group and bilateralIBM+IV group. The percentages of H2Db cell subsets in the three IBM groups were much higher than  that in IV group. There was no significant difference of the engraftment level in the injected side tibia between the unilateral and bilateralIBM  group. When secondary transplantation was performed, the engraftment level in  bilateralIBM group was still much higher than that in IV group. At day 90, the survival rates of IBM groups were all ≥ 80%, while that of IV group was only 50%. It is concluded that  bilateralIBM route can facilitate the homing of more HSCs, accelerate the engraftment of HSCs and hematopoietic reconstitution, which promoted the efficacy of IBMHSCT.

Key words    intrabone marrow  transplantation; intravenous transplantation;  hematopoietic stem cell transplantation

    J Exp Hematol 2007; 15(5):998-1004

     外周静脉输注（intravenous injection， IV）是广泛应用的造血干细胞( hematopoietic stem cell, HSC)移植途径。目前研究显示，IV输入的HSC可滞留于富含毛细血管床的非造血组织，减少了骨髓归巢总量，从而影响HSC的植入效率，尤其是对于输入细胞数有限的脐血移植而言，其影响更大。2001年Kushida等［1］首次报道旨在促进HSC归巢的骨髓腔内（intrabone marrow， IBM）移植。本研究在前期建立的同种异基因小鼠骨髓腔内脐血移植模型基础上［2］，比较不同途径输注小鼠脐血替代品胎鼠及新生鼠外周血（fetal and neonatal peripheral blood，  FNPB）细胞在受体内的分布特点及对移植效果的影响，为临床应用提供实验基础。

    材料和方法

    实验动物

    无特定病原体（SPF级）BALB/c（H2Dd）雌性小鼠为移植受体，7-8周龄，体质量16-18 g，由中山大学实验动物中心提供；SPF级C57BL/6（H2Db）小鼠为移植供体，10-12周龄，体质量22-25 g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司。实验小鼠置于无菌层流室动物洁净饲养柜中，饲料、饮用水及垫料均经高压灭菌处理，受鼠不添加抗生素或抗排斥反应药物，所有操作均在无菌层流环境中进行。

    主要试剂

    羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester, CFSE）（Molecular Probes公司产品）、藻红蛋白（phycoerythrin， PE）或异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate， FITC）标记大鼠抗小鼠H2Db、CD117、Sca1单克隆抗体（美国PharMingen公司产品）、甲基纤维素半固体培养基MethocultTMGFM3434(美国Stem Cell公司产品)、IMDM干粉培养基（Gibco公司产品），胎牛血清（Hyclone公司产品）、NycoPrepTM 1.077A（AxisShield公司产品）。

    FNPB细胞的制备及原始造血干细胞检测

    取胎龄18-19天胎鼠或出生24小时内新生鼠外周血，按本室方法［2］制备单个核细胞（MNC）悬液， 用IMDM培养液调整细胞浓度为5×106/ ml、3.3×107/ml、2×107/ml、2.5×106/ml、1×106/ml，于取血后3小时内移植受鼠。同时应用流式细胞仪检测同一孕鼠的FNPB和骨髓细胞中CD117+ Sca1+表达情况。部分FNPB细胞以终浓度10 μmol/L 的CFSE染色，移植受鼠行体内示踪检查。染色后即时观察染色效果，并置于37℃、 5% CO2及饱和湿度条件下培养96小时，观察荧光强度的变化。

    动物分组及FNPB输注方法

    BALB/c雌鼠随机分为6组，① - ③组每组50只，④ - ⑥组每组30只。移植组每只受鼠接受FNPB  MNC 1×106输注。①单侧IBM组：右侧胫骨IBM注射；②双侧IBM组：双侧胫骨各注射FNPB MNC 5×105；③IV组；④双侧IBM+ IV组：双侧胫骨各IBM注射FNPB MNC 2.5×105+IV注射FNPB MNC 5×105；⑤ 照射对照组：单侧IBM注射IMDM培养液30 μl；⑥ 空白对照组：不照射，单侧IBM注射IMDM培养液30 μl。①-⑤ 组于移植前8小时接受6.0Gy的60Coγ射线全身一次性辐照，剂量率1.3 Gy/min。受鼠术前均以43 g/L水合氯醛430 mg/kg腹腔麻醉。IBM注射时参照文献［1］略为改良，无需手术切口，直接用1 ml UltraFineTM Needle 胰岛素注射器（29G针头）行单侧或双侧胫骨腔注射。IV注射时经尾静脉一次性注射FNPBMNC悬液。

    CFSE标记FNPBMNC体内示踪

CFSE标记FNPBMNC输注后分别于5分钟、24小时、72小时随机选择单侧IBM组、双侧IBM组、IV组各6只受鼠，取眼静脉血涂片，注射侧胫骨、股骨、肝、脾、肺、胸腺各行冰冻切片5-10张，片厚5 μm，荧光显微镜下每片取5-10个非重叠视野，计数每个视野中荧光细胞数（×100）。判定标准为： （）每个视野未发现绿色或橙色荧光细胞；（+）1-5个阳性细胞；（++）5-10个阳性细胞；（+++）阳性细胞＞10个；（++++）阳性细胞聚集成团块或云絮状，数量多而无法计数。另于上述时点制备受鼠脾脏、注射侧胫骨、股骨、外周血MNC细胞悬液，FACScan流式细胞仪检测绿色荧光细胞比例。

    受鼠一般情况观察

    每日观察FNPBMNC移植后受鼠生存情况至移植后3个月，绘制生存曲线。

    受鼠造血重建的检测

    移植后第10、14、21、30天用KX21血细胞计数仪检测各组存活小鼠外周血WBC、Hb、Plt；同时取受鼠双侧胫骨、股骨骨髓有核细胞2×104加入1 ml甲基纤维素半固体培养体系置于37℃、5% CO2及饱和湿度的培养箱中，按照文献［3］方法于接种后7天计数CFUGM，14天计数BFUE、CFUGEMM，21天计数CFUHPP； 第21天处死各组存活受鼠，取注射侧胫骨及股骨行石蜡切片、HE染色，光镜检查骨髓增生情况。

    受鼠移植物抗宿主病检查

    观察受鼠有无脱毛、腹泻、出血、皮肤黏膜溃烂等情况，取移植后出现GVHD表现的受鼠和存活至第28天的受鼠足垫皮肤、肝脏、肠管观察组织病理学改变。

    受鼠植入证据与植入水平检测

    分别取第14、30、90天受鼠注射侧胫骨细胞悬液，FACScan流式细胞仪检测FITC标记大鼠抗小鼠H2Db的表达情况，对照为IgG1FITC。

    二次移植实验

    制备双侧IBM组存活90天以上受鼠的胫、股骨骨髓细胞悬液，输入经同样剂量60Coγ射线辐照的BALB/c雌鼠。12只受鼠随机分为双侧IBM组或IV组，每组6只，移植细胞数5×106。观察移植后受鼠生存情况，并于第60天以流式细胞仪检测存活受鼠外周血中H2Db+细胞比例。

    统计学处理

    计量资料以(均数±标准差)表示。以SPSS 11.5统计软件作t检验或单因素方差分析及最小有意义差异t检验，作KaplanMeier生存函数曲线及Log rank检验，检验水准设α=0.05。

    结    果

    C57BL/6鼠FNPBMNC染色及原始造血干细胞检测结果

    FNPBMNC经CFSE染色后染色率＞95%（图1），培养96小时后细胞形态、荧光强度无明显改变。流式细胞仪检测其CD117+ Sca1+细胞比例为（3.73±1.29）%，明显高于骨髓细胞（1.28±0.68）%的检测值（t =5.30，p＜0.01）（图2）。

    不同途径输注FNPB体内分布情况

    CFSE标记FNPBMNC输注后5分钟 ，单、双侧IBM组注射处骨髓腔有许多绿色荧光细胞（+++-++++），以单侧IBM组最多，其他部位未见带绿色或橙色荧光细胞。IV组外周血荧光细胞（+++），髓外组织（+）；24小时时，单侧IBM组注射部位的阳性细胞

    Figure 3.  Tracing of CFSElabeled FNPBMNC  in BM at 72 hours after transplantation（×100）. A： tibia of bilateral IBM injection group. B: injected side tibia of unilateral IBM injection group. C: femur of IV group.

    （++++），外周血、肺部可见少量荧光细胞，而股骨、肝、脾、胸腺（++）。双侧IBM组注射处阳性细胞（+++～++++），股骨、肝、脾、胸腺（+），肺及外周血（-）。IV组骨髓腔内阳性细胞（+-++），外周血（+），其他组织（++-+++）；72小时时，单侧IBM组注射侧胫骨、股骨均可见荧光细胞，但仍以注射侧胫骨为多（+++），其它部位（-）或（+）。双侧IBM组胫骨中荧光细胞计数与24小时情况相似，其它部位罕见阳性细胞。IV组胫骨、股骨、肝、脾切片见阳性细胞少量，肺部仍为（++）（图3及表1）。

移植后5分钟, 流式细胞仪检测单侧IBM组注射侧胫骨细胞中（1.537±0.136）%为CFSE标记FNPBMNC，双侧IBM组两侧胫骨的检测值分别为（0.843±0.160）%、（0.813±0.106）%。两个IBM移植组经骨髓腔内注射的FNPBMNC总数相同，双侧IBM组股骨、外周血、脾脏中阳性细胞比例均小于单侧组，但差异无统计学意义。两个IBM移植组注射部位骨髓中的供体细胞比例明显高于IV组（F=183.66，p＜0.01），而股骨、脾脏、外周血中的分布则显著低于IV组，提示IBM注射的FNPB MNC即刻渗漏至外周血或其它组织的比例极少； 24小时，两个IBM移植组注射侧胫骨中荧光细胞比例有所下降，但仍显著高于股骨和IV组，脾脏、股骨中的比例有所升高，以单侧IBM组较为显著，提示IBM注射的FNPB在该时已通过血液循环到达其它组织，但大部分仍是"定居"于注射侧骨髓腔，尤其是双侧IBM组在注射部位的分布比例最高；72小时时，单侧IBM组注射侧胫骨供体的细胞比例为（0.888±0.234）%，双侧IBM组相应比例分别为（0.622±0.073）%、（0.632±0.046）%，IV组胫骨检测值仅为（0.093±0.120）%，统计分析结果与24小时的情况一致(表2)。

    移植后受鼠生存状况

    FNPBMNC移植过程中受鼠无异常表现。照射对照组部分小鼠于第14-18天死亡，90天存活率40%；单侧IBM组有1只于第19天死亡，双侧IBM组全部存活，双侧IBM+IV组有2只受鼠于第19、20天死亡，90天生存率分别为90%、100%和80%；IV组生存率50%，小鼠死亡时间为第15-18天。病理检查提示死因为骨髓造血衰竭。各组KaplanMeier生存函数曲线见图4，单侧或双侧IBM组、双侧IBM+IV组与照射对照组生存曲线之间的差别具统计学意义（QPH = 16.0，p=0.003），而IV组与照射对照组的生存曲线无明显差异（QPH = 0.22，p =0.6405）。单、双侧IBM组的生存率无显著差异且都明显优于IV组，双侧IBM+IV组与IV组及单、双侧IBM组的差别尚无统计学意义（QPH 值分别为2.61、0.35、2.11，相应p值为0.1061、0.5567、0.1464）。

    Figure 4.  Survival plots of recipient mice after FNPBMNC transplantation.

    外周血象的恢复

    照射后3个IBM组血红蛋白（Hb）回升较快，第21天基本恢复，而白细胞(WBC)、血小板(Plt)则于第30天达正常水平，尤以双侧IBM组恢复最为迅速，第21天时WBC、Hb、Plt已分别达到（8.84±1.02）×109/L、（160.2±6.7）g / L和（406.6±66.6）×109/L，而IV组、照射对照组外周血象多于第30天恢复。单、双侧IBM组相比无显著差异，但移植早期3系细胞计数值都高于IV组和照射对照组。双侧IBM+IV组血象回升速度亦快于IV组，尤其是WBC计数在第10、14天差别明显（p＜0.05），但总体水平仍低于单、双侧IBM组。

    受鼠骨髓造血干祖细胞集落变化

    3个IBM组各个时点骨髓造血干祖细胞集落产率均高于IV组和照射对照组，于第21天已趋于正常水平，尤以双侧IBM组最佳。IV组、照射对照组在第30天才基本达到正常水平。3个IBM组在CFUGM、BFUE、CFUGEMM计数方面无显著差异，仅于第10天双侧IBM组的CFUGEMM计数明显高于双侧IBM+IV组（p＜0.05），而双侧IBM组CFUHPP计数在第14天与其它两组的差别有统计学意义（表3、4）。

    受鼠骨髓增生情况

    第21天时IBM注射侧胫骨有核细胞增生极度活跃，以单侧IBM组最为明显。股骨髓腔细胞增生明显活跃，3个IBM移植组之间无显著差别。IV组胫骨骨髓增生亦活跃，但有少量纤维组织伴纤维网格形成。照射对照组存活小鼠胫骨切片与IV组基本相同。

    移植后受鼠GVHD

    IV组1只受鼠第13天排黄色水样便，第15天死亡，病理检查提示肠道GVHD。其它受鼠未发现GVHD症状。

供体植入水平

    移植后受鼠骨髓中H2Db+细胞逐渐增多，各个时点均以单侧IBM组注射侧胫骨比例最高，但与双侧IBM组无显著差异。第90天时单侧IBM组注射侧胫骨阳性细胞占（22.16-38.47）%，提示供体细胞植入并呈嵌合状态。各组中FNPB MNC注射部位的阳性细胞比例也明显高于IV组胫骨骨髓细胞检测值（表5）。

    二次移植受鼠生存率及供体植入水平

    接受二次移植的2组受鼠60天存活率在双侧IBM组为100%(6/6)、IV组为66.7%(4/6),无显著性差异。双侧IBM组、IV组外周血H2Db+细胞分别为（9.31±4.20）%、（2.47±1.18）%，差异明显（t =3.12， p =0.014）。

    讨    论

    以骨髓腔输注促进有限的HSC归巢骨髓是有望解决UCBT造血恢复延迟的策略之一［4］。本课题组前期已成功建立同种异基因小鼠骨髓腔内脐血移植模型，发现单侧IBM注射可通过促进HSC归巢而明显改善其造血重建能力，提高受体存活率［2］。现进一步对不同移植途径（包括双侧IBM输注、IBM/IV混合输注）进行比较，以选择最佳的HSCs输注方式。

    我们采用经典的近交系小鼠C57BL/6（H2Db）BALB/C（H2Dd）同种异基因移植模型，移植物为FNPBMNC。以CD117+ Sca1+双标记检测FNPBMNC，其比例明显高于骨髓细胞，提示FNPB较骨髓富含更早期造血干/祖细胞，具有更高的增殖潜能，可作为脐血研究的替代品。本研究以透膜荧光染料CFSE标记FNPBMNC，体外培养96小时细胞形态、荧光强度无明显改变，进行体内示踪的受鼠无异常表现，有较好的标记率和安全性。根据文献资料［5］，CFSE标记多用于短期的体内示踪，因此本研究仅在移植后5分钟、24小时、72小时进行检测，而以H2Db水平作为供体细胞长期植入的标志。

    任何途径输注的HSC必须归巢、定居于骨髓造血微环境中合适"龛位"才能进一步增殖、分化和重建造血。IBM途径旨在直接增加HSC归巢，减少骨髓外组织滞留，使更多的HSC能定植于骨髓。Yahata等［6］发现，人脐血CD34+细胞经IBM途径输入NOD/SCID小鼠时植入频率为1/44，IV组为1/660，两者相差15倍。Kimura等［7］ 发现，人脐血Lin-CD34-细胞IBM输注入NOD/SCID鼠体内可植入并重建造血，但静脉输注时因其归巢相关受体表达水平较低、难以归巢骨髓而无法植入。本研究比较了单侧/双侧IBM、IV途径HSC输注后体内动力学差异，发现IBM注射的供体FNPBMNC主要积聚于注射侧骨髓腔内，少量MNC可经血循环到达外周血、肝、脾、其它长/扁骨骨髓腔等部位，肺部滞留很少。而以尾静脉注射的FNPBMNC归巢骨髓的数量显著少于2个IBM组，肺部有明显供体细胞滞留，提示IBM较IV途径有利于HSC归巢骨髓，对于移植细胞数量有限的UCBT更具有应用价值；单侧IBM组非注射部位长骨与IV组骨髓腔内荧光细胞量基本相当，说明单侧胫骨IBM输注时少量HSC可进行再次的归巢和种植；单/双侧IBM相比，2个移植组经骨髓腔内输注的FNPBMNC总数无明显差异，但72小时时后者每侧胫骨标记细胞比例与前者注射侧胫骨无显著差异，但骨髓外组织观测值明显低于单侧IBM组，表明经双侧IBM输入HSC渗漏至外周血或其它组织器官的比例更少，提示双侧IBM输注甚至多部位IBM输注可进一步提高HSC的骨髓归巢总量。

    在人鼠脐血移植模型中发现，IBM途径可以明显促进HSC植入和受体造血功能的恢复。Castello等［8］将NOD/SCID 鼠IBM输注的人脐血细胞数减少到1/10，发现第30、60、90天时IBM组与IV组CD45+、CD45+/CD34+细胞含量无明显差异，可见IBM途径具有更高的移植效率。孙爱红等［9］认为，IBM途径的优势可能与"大剂量造血干细胞移植效应"和"减少循环扣留作用"有关。陈宝安等［10］建立非清髓性预处理联合骨髓腔内异基因骨髓移植小鼠模型,发现移植后受鼠中供鼠的皮肤移植物平均存活时间较对照组明显延长(p<0.01),受鼠逐渐呈现供鼠颜色特征。MLR证明受鼠获得供体特异性耐受,该耐受可以被IL2逆转且可被过继转移，提示非清髓预处理联合髓腔内骨髓移植可有效地诱导异基因小鼠免疫耐受。

本研究表明， IBM输注能促进HSCT小鼠造血重建，表现为IBM各组无论是在外周血象的恢复速度，还是骨髓增生状况、造血干祖细胞集落产率方面均优于IV组，尤其是双侧IBM组造血恢复速度最快，其外周血WBC、Plt计数和造血干祖细胞集落计数在移植后第21天已接近正常水平，而单侧IBM组、双侧IBM+IV组次之。IBM输注可提高植入水平，IBM移植组各个时间点供体来源细胞的比例均明显高于IV组，获得较高的供体嵌合比例。其中单侧IBM组在移植后14、30、90天注射侧骨髓中供体来源细胞的比例分别达到（7.23±1.34）%、（20.38±3.01）%和（29.53±6.64）%，同时双侧IBM组注射侧胫骨骨髓细胞中H2Db的表达水平与单侧IBM组相应检测值无明显差异，提示双侧IBM注射可使移植细胞在受体骨髓中的分布得以优化。二次移植中双侧IBM组的植入水平也明显高于IV组；IBM输注还可提高生存率，IBM移植组小鼠90天存活率≧80%，双侧IBM组达到100%，而IV组仅为50%，提示双侧IBM对受体生存率的提高更具优势。

    综上所述，IBM途径使供体HSC直接归巢骨髓，减少其在髓外组织内的滞留，双侧IBM有利于更多供体HSC归巢，促进造血恢复；同种异基因小鼠骨髓腔内移植模型进一步证实IBM途径对促进HSC植入、造血功能重建、提高HSCT效果方面优于IV途径，并以双侧IBM移植效果更佳，这为进入临床UCBT提供了实验依据。

【参考文献】  1Kushida T, Inaba M, Hisha H, et al. Intrabone marrow injection of allogeneic bone marrow cells: a powerful new strategy for treatment of intractable autoimmune diseases in MRL/lpr mice. Blood, 2001; 97:3292-3299

2蔡耘, 黄绍良, 陈凤英等. 同种异基因小鼠骨髓腔内脐血移植模型的建立及其对造血干细胞植入的影响. 中山大学学报·医学科学版, 2005; 26 : 644-650

3郑德先，吴克复，褚建新主编. 现代实验血液学研究方法与技术. 北京: 北京医科大学中国协和医科大学联合出版社, 1999: 36-59

4Brunstein CG, Wagner JE. Umbilical cord blood transplantation and banking. Annu Rev Med，2006; 57:403-417

5Dooner M, Cerny J, Colvin G, et al . Homing and conversion of murine hematopoietic stem cells to lung. Blood Cells Mol Dis, 2004; 32:47-51

6Yahata T, Ando K, Sato T, et al. A highly sensitive strategy for SCIDrepopulating cell assay by direct injection of primitive human hematopoietic cells into NOD/SCID mice bone marrow. Blood, 2003; 101 : 2905-2913

7Kimura T, Wang J, Matsui K, et al. Proliferative and migratory potentials of human cord bloodderived CD34 severe combined immunodeficiency repopulating cells that retain secondary reconstituting capacity. Int J Hematol, 2004; 79:328-333

8Castello S, Podesta M, Menditto VG, et al. Intrabone marrow injection of bone marrow and cord blood cells: an alternative way of transplantation associated with a higher seeding efficiency. Exp Hematol, 2004; 32:782-787

9孙爱红，冯四洲，刘 斌等. NOD/SCID小鼠脐血单个核细胞骨髓腔内移植的实验研究. 中华血液学杂志, 2005; 26:261-264

10陈宝安，毕延智，丁家华等. 非清髓性骨髓移植诱导异基因受者小鼠免疫耐受的实验研究. 中国实验血液学杂志, 2005; 13: 1054-1057