冷冻干燥保存血小板的实验研究

作者：刘景汉，周俊，王冬梅，欧阳锡林，邢颜超，卢发强   

作者单位：解放军总医院输血科，北京 100853

 【关键词】  可逆性激活抑制剂

     Experimental Study on Lyophilization of Platelets

    LIU JingHan, ZHOU Jun1, WANG DongMei1, OUYANG XiLin, XING YanChao1, LU FaQiang

    Department of Blood Transfusion,  General Hospital of  Chinses PLA, Beijing 100853, China; 1Department of Blood Transfusion,  Urumqi  General Hospital, Lanzhou Military Area, Urumqi 830000, China

    Abstract    The aim of this study was to search a procedure of platelet lyophilization and find a way of longterm sto rage of human platelets at normal temperature with smaller  size and lighter weight, to be convenient to transport at long distance thus to meet the demands in accidents and war time. Human platelets were pretreated  by freezing,  the first and  the second desiccation, and  were added with reversible activationinhibitors of platelets, DMSO and trehalose, then were rehydrated.  At the same time,  the recovery rate of platelets, platelet maximal aggregation induced by thrombin, coagulation of platelets, CD62p expression and PAC1 expression were assayed.   The results indicated that the recovery rate of the plalelets was 56.29%. The  platelet maximal aggregation induced by thrombin had no significant difference between lyophilized platelets and  the fresh plateletrich plasma (FPRP), but the aggregation of platelets   induced by ADP or propyl gallate was decreased by 49.34% and 26.25%. Coagulation of the lyophilized platelets  was  not significantly different from FPRP. CD62p expression of the lyophilized platelets  (42.36％)  was higher than  that in  FPRP while PAC1 expression was 2.12%. CD62p reexpression rate induced by thrombin was 50.88% and PAC1  reexpression was 54.55%.  It is concluded that the ability of recovered lyophilized platelets added with reversible activationinhibitors, DMSO and trehalose  to aggregate and coagulate has showed  no significant difference  as compared with  FPRP. The reversible activationinhibitors can decrease CD62p  expression of lyophilized platelets, and may enhance their  survival ability   and  prolongate survival time. Therefore the efficiency of lyophilizing platelets can  be  improved based on  this freezedrying procedure.

    Key words    platelet; lyophilization; activationinhibitor; trehalose; DMSO

    J Exp Hematol 2007; 15(5):1098-1101

    由于冻干制品能在常温下保存、性能稳定、便于运输，因而冷冻干燥技术已广泛应用于各种生物材料的保存。目前的血小板保存方法使其应用和运输受到很大的限止，冻干是血小板最理想的保存方法，冻干的血小板能在常温条件下保存、占用空间小、重量轻、便于运输等，尤其能应付突发事件以及战场救治的需要。因此，冻干保存血小板的研究几十年来一直吸引着各国学者的关注。本研究利用海藻糖、可逆性血小板功能抑制剂和二甲亚砜等低温保护剂，冷冻干燥保存血小板，现将研究结果报告如下。

材料和方法

    血小板来源

    血小板取自自愿供血者。自愿供血者献血前1天内禁饮含酒精类饮料，2周内未服用阿司匹林等抗血小板及抗凝血的药物。应用COBE Spectra血液分离机采集浓缩血小板（PCs）。

    主要试剂及溶液

    试剂  植酸钠（Phylocid sodium, Sigma公司产品），百维利肽（Bivalirudin, Medicine公司产品）左旋精氨酸（Larginine, Sigma公司产品），PGE1（商品名保达新）、海藻糖（trehalose)购自南宁中诺生物工程公司）、二甲亚砜（DMSO，天津医药公司产品）。荧光素标记的特异性血小板膜表面抗体及相关多肽：PAC1－FITC， CD62P－PE，CD61－PerCP，MIgGI－PE等购自Becton Dickinson公司；RGDS肽和GPRP （GlyProArgPro乙酸盐）购自Sigma公司产品。血小板聚集诱导剂包括：凝血酶（thrombin，  Sigma公司产品），二磷酸腺苷（ADP， Sigma公司产品），丙基没食子酸（Propyl gallate， Analytical ControlSystems公司产品）。

    MEK6108K型全自动血细胞分析仪（Nihon Kohden公司产品），APACT2聚集仪（德国Lanbo公司产品），FACSCalibur流式细胞仪（Becton Dickinson公司产品）和CellQuest分析软件， Centrifuge 5415D离心机（Eppendorf），Biofuge15R（Heraeus公司产品），台式冷冻干燥机（TFFD1）。

    实验分组

    实验为配伍设计，5份PCs，各准备15 ml。设对照组和2个实验组，对照组为新鲜富含血小板血浆（FPRP），不进行任何处理。每份PCs分3个试管，2ml/tube，分至各组，剩余的离心（2 287×g,15分钟），留取少量血小板血浆（PPP）备用。

    前处理（海藻糖负载）

    血小板中加入预处理液，实验组1含海藻糖 45 mmol/L和DMSO 3%，实验组2含海藻糖 45 mmol/L，DMSO 3%，PGE1 1 μmol/L，LArg 5 mmol/L，Phy 0.5 mmol/L和Bivaridin 0.5 μmol/L。将各组样品混匀后，37℃水浴4小时，每20分钟振摇1次。

    血小板冷冻干燥、预水化和再水化

    血小板悬液1 111×g离心8分钟，用冷冻干燥液1 ml（HEPES 9.5 mmol/L，NaCl 142.5 mmol/L，KCl 4.8 mmol/L，MgCl2 1.0 mmol/L， trehalose 150.0 mmol/L，PGE1  1 μmol/L， LArg 5 mmol/L，Phy 0.5  mmol/L， Bivaridin 0.5 μmol/L，DMSO 3%，人血清白蛋白 5%）在硅化后的玻璃瓶中重悬血小板，血小板PCT为40%-50%，干燥厚度<1 cm，进行冷冻干燥。

    冷冻  ①以5℃/分钟的速度从22℃降至-5℃； ②以2℃/分钟从-5℃降至-60℃;  ③ -60℃以下维持1小时以上。

    干燥  一级干燥，－30℃，1小时，50 mTorr；二级干燥，架上温度以0.2℃/分钟的速度从-30℃升至20℃，50 mTorr。一级干燥和二级干燥之间采用快速直接升温，避免梯度升温。真空干燥完毕后，样品室温下在冻干机中至少放置24小时，然后用于试验或封装保存室温或4℃放置。

    预水化  冻干的血小板在37℃湿度饱和的密闭环境中水浴4小时，使水含量达25％左右。

    再水化  预水化处理后，按1∶4进入等渗的复水液/H2O（3/1, V/V）中再水化。复水液含NaCl 116.0 mmol/L，枸橼酸钠 13.6 mmol/L，Na2HPO4  8.6 mmol/L， KH2PO4 1.6 mmol/L， EDTA 0.9 mmol/L，葡萄糖 11.1 mmol/L，PGE1 1μmol/L，LArg 5 mmol/L，Phy 0.5 mmol/L，Bivaridin 0.5 μmol/L，DMSO 3%，pH=6.8。

    血小板回收率

    血小板回收率=（复水后血小板数目／冻干前血小板数目）×100％

血小板聚集试验

    各诱导剂作用浓度为thrombin 1 U/ml，ADP 20 μmol/L， propyl gallate 50 μl。PPP聚集率为0%，PRP聚集率为100％。原血浆调整PRP血小板浓度至(200-300)×106/ml，反应体积250 μl。

    血小板膜表面CD62p、PAC1的表达率

    采用流式细胞术（FCM）测定血小板膜表面CD62p、PAC1d阳性表达率，操作参照常规检查步骤。以CD61表达和SSC作为选定血小板的条件R1，获取10 000个血小板（速度300个/秒）进行FL1（PAC1－FITC）和FL2（CD62p－PE）双参数分析。以阴性对照管，调节阳性区的假阳性率<1％，用单纯血小板和各阳性单染（抗CD61单染，抗CD62p单染和抗PAC1单染对照）加阴性对照校正荧光FL1，FL2。建立获取模式后检测测定管。

    血小板膜表面CD62p ，PAC1再表达率

    经Thrombin激活后测定CD62p ，PAC1的阳性率，计算再表达率方法同上。再表达率=凝血酶处理后表达率－血小板表达率［1］

    血小板促凝血活性（SPAT）

    用玻片法检测。在洁净塑料薄片上，加100 μl PRP ［（200-300）×106/ml］，加入等量SPAT试剂，混匀后立即计时，单位为秒（s），新鲜富含血小板血浆（FPRP）为实验对照，记录结果。

    结    果

    冻干血小板的回收率

    经冷冻干燥、再水化后，两个实验组血小板计数显著低于对照组（p<0.01），血小板回收率分别为53.67％和56.29%，实验组之间未见明显差异（表1）。

    血小板最大聚集率（PAgT）

    凝血酶诱导的血小板聚集，冻干的血小板与新鲜血小板无明显差异(p>0.05);ADP和propyl gallate诱导的血小板聚集，冻干的血小板显著低于新鲜血小板（p值均<0.01），聚集抑制率均<50％（表2）。

    血小板膜表面CD62p和PAC1的表达和再表达率

    再水化后的冻干血小板实验组1 CD62p表达率高达97.19％，实验组2  CD62p表达42.36％，均显著高于对照组（4.18±3.91）（ p值均<0.01）；实验组间CD62p表达差别显著，实验组2显著低于实验组1（ p<0.01）。实验组1 CD62p再表达率为0.31%，实验组2 CD62p再表达率为50.88％，显著高于实验组1（ p<0.01）。两个实验组血小板PAC1表达均较低，与对照组相比较无显著性差异（p值均>0.05）；凝血酶作用后的PAC1再表达及再表达率均与对照组接近，未见明显差异（表3）。

    血小板促凝血活性

    冻干的血小板再水化后仍保留良好的促凝血活性，与新鲜血小板无显著性差异，实验组间也未见明显差异（p均>0.05）（表4）。

    Table 4. SPAT* of rehydrated platelets （ ±SD, n=5）

    GroupSPAT（s）pFPRP70.6±5.81Test 164.0±19.10.482Test 269.4±9.620.503SPAT: slide platelet aggregation test.

    讨    论

    为最大限度地保存血小板功能，延长保存的血小板在体内生存时间、减少处理和保存过程中的激活损伤是关键［2］。因此本研究以血小板激活抑制剂筛选实验结果为基础［3］，选择了经过多次正交设计实验后初步确定的多种血小板可逆性抑制药物的组合，如前列腺素E1，左旋精氨酸，植酸钠和百维利肽等，进行冷冻干燥保存血小板的实验研究。该抑制剂组合可抑制血小板体外激活，并且抑制作用可逆，以保证输入体内后血小板具有黏附、释放、聚集等活性并具有一定存活时间。

    左旋精氨酸和前列腺素E1均作用于血小板环核苷酸系统，抑制cAMPPDE（环磷酸腺苷－磷酸二酯酶）活性，减少cAMP降解，使cAMP浓度升高。左旋精氨酸为NO释放剂。抑制PDE活性，减少cAMP降解，使cAMP浓度升高。近年来一些学者发现，NO可抑制血小板的活化和聚集，被 称为内源性血小板聚集和黏附抑制物［4］。有实验证实，在离体的血小板上清液中，加入类NO物质硝酸盐时可见到血小板活性的抑制现象［5］。前列腺素E1既具有抑制TXA2合成酶的作用，又是腺苷酶环化酶激活剂，对血小板花生四烯酸系统和环核苷酸系统均有作用。它可抑制TXA2合成，促进cAMP合成，从而抑制血小板聚集。植酸又名肌醇六磷酸（inostol hexaphosphoric acid），一种抗血小板粘聚药物。巴伐卢定（bivalirudin），直接凝血酶抑制剂，一种水蛭素类似物，是一个能与凝血酶活性位点结合，由20个氨基酸残基组成的半合成多肽链。它通过4甘氨酸与水蛭素羧基端上的十二碳多肽类似物相连［6］。与水蛭素一样，巴伐卢定也能与凝血酶结合形成1∶1复合物，抑制其活性，但抑制作用短暂［7］。

 血小板被激活时，颗粒膜和质膜融合为颗粒膜蛋白，血小板膜糖蛋白CD62p（P选择蛋白）在血小板膜表面表达；血小板质膜表面糖蛋白表位GPIIb/IIIa，也因构象变化而显露，因此选择CD62p和PAC1作为血小板活化检测指标。用FACs测定荧光标记的CD62p抗体阳性表达的血小板百分率可反映血小板活化程度［8］。有研究证明，保存血小板CD62p阳性率与相应血小板体内存活率和存活期呈负相关［9，10］。实验结果表明，不含血小板激活抑制剂的方法冻干的血小板再水化后CD62p表达率高达97.19％，提示用该法制备的血小板制品输注体内后不能满足以提高外周血血小板数目为目的的临床需求，但该制品仍具有较好的聚集活性和促凝血活性，可能具备体内即刻止血功能。添加血小板激活抑制剂可显著降低CD62p的表达，激活抑制剂的加入可能会提高血小板制品体内存活率和生存期。P选择素的主要来源是α颗粒，在血小板激活时P选择素表达于血小板膜表面，同时释放α颗粒的内容物。采用足够浓度的凝血酶充分激活血小板后，CD62p再表达的能力能反映保存血小板的功能状态，测定平均荧光强度则可反映总的血小板α颗粒的释放能力［11］。实验研究中，加入可逆性抑制剂后，获得的血小板制品的α颗粒的释放能力为50.88％，与不加血小板抑制剂的制品有显著差异。由于存在已经释放的活性物质，因此在高表达CD62p的状况下，产品仍具有较好的聚集和促凝血功能，激活抑制剂的加入提高了该冻干保存方法的效率。在Wolkers等［12，13］冻干人及动物血小板研究中，以PGE1作为保护剂负载和冻干过程的血小板功能保护剂，冻干血小板仍保持对标准浓度的凝血酶、胶原、ADP和瑞斯托菌素等诱导剂的聚集反应，与本实验获得的保存效果一致。

    因此，针对血小板体外激活不同途径，选择可静脉注射的可逆性血小板抑制剂及海藻糖，用于血小板低温和冷冻干燥保存是血小板的长期保存切实可行的方法。但对该方法保存期限、体内输注评价，以及如何增加冻干保存容积等问题，还需进一步研究。

【参考文献】  1欧阳锡林, 刘景汉, 高大勇. 流式细胞术测定保存血小板再表达CD62p方法的建立及应用. 中国输血杂志， 2002; 15:77-81

2周俊, 刘景汉. 血小板冻干保存的研究进展. 中国实验血液学杂志, 2004;12:542-545

3王冬梅, 刘景汉, 周俊等. 腺苷对血小板体外激活的抑制作用. 中国实验血液学杂志,2005;13:1094-1098

4Loskove JA, Frishman WH. Nitric oxide donors in the treatment of cardiovascular and pulmonary diseases. Am Heart J,1995; 129:604-613

5DeCaterina R. Nitrate als thrombozytenfunktionshemmer. Z Kardiol,1994; 83:463-473

6王建中,曹凌,袁家颖等. 三种抗血小板药物在体外对血小板活化的抑制作用研究. 中华检验医学杂志,2002; 25:8-11

7SkrzypczakJankun E, Carperos VE, Ravichandran KG, et al. Structure of the hirugen and hirulog 1 complexes of alphathrombin. J Mol Biol, 1991; 221:1379-1393

8彭黎明,杨菁. 血小板功能检测及其应用的研究进展.中国实验诊断学,2001; 5:214-217

9Holme S, Sweeney JD, Sawyer S, et al. The expression of Pselectin during collection, processing, and storage of platelet concentracts: relationsip to loss of in vivo viability. Transfusion, 1997; 37: 12-17

10Michelson AD, Barnard MR, Hechtman HB, et al. In vivo tracking of platelets: circulating degranulated platelets rapidly lose surface Pselectin but continue to circulate and function. Proc Natl Acad Sci USA, 1996; 93:11877-11882

11Johnston GI, Pickett EB, McEver RP, et al. Heterogeneity of platelet secretion in response to thrombin demonstrated by fluorescence flow cytometry. Blood, 1987; 69: 1401-1403

12Wolkers WF, Walker NJ, Tablin F, et al. Human platelets loaded with trehalose survival freezedrying. Cryobiology, 2001; 42: 79-87

13Wolkers WF, Looper SA, Fontanilla RA, et al. Temperature dependence of fluid phase endocytosis coincides with membrane properties of pig platelets. Biochim Biophys Acta, 2003; 1612: 154-163