肾细胞癌组织中△Np63和MDM2蛋白的表达及其临床意义

作者：赵海军   

作者单位：青岛市第八人民医院泌尿外科，山东 青岛 266100 【摘要】  目的 探讨△Np63和MDM2蛋白在肾细胞癌组织中的表达及其与肿瘤侵袭与转移的关系。方法应用免疫组织化学SP法，检测76例肾细胞癌和14例正常肾组织中△Np63和MDM2蛋白的表达。结果 肾癌组织与正常肾组织中△Np63、MDM2蛋白的表达差异有显著性（F=28.34、22.57,q=6.471～12.529,P<0.05）；不同病理类型的肾癌组织中△Np63、MDM2蛋白的表达差异均无显著性（q=0.093～2.169,P>0.05）；不同临床分期肾癌组织中△Np63、MDM2蛋白的表达差异有显著性（F=24.59、10.82,q=4.694～11.971,P<0.05）。△Np63和MDM2蛋白的表达存在着显著相关性（rs=0.513,P<0.05）。结论 △Np63和MDM2蛋白可以作为反映肾细胞癌侵袭和转移潜能的生物学指标。 【关键词】  肾肿瘤 △Np63 原癌基因蛋白质cmdm2 免疫组织化学　　EXPRESSION AND CLINICAL SIGNIFICANCE OF △Np63 AND MDM2 PROTEINS IN RENAL CELL CARCINOMA　　ZHAO HAIJUN 　　The Eighth People’s Hospital of Qingdao, Qingdao 266100, China　［ABSTRACT］ Objective To explore the expressions of △Np63 and MDM2 proteins in renal cell carcinoma (RCC) and their relationship with the tumor invasion and metastasis. Methods Using immunohistochemical method, △Np63 and MDM2 in 76 RCC, and 14 normal renal tissues were detected. Results The expressions of △Np63 and MDM2 in RCC and in normal renal tissue showed significantly different between them (F=28.34,22.57;q=6.471-12.529;P<0.05); which were not related to pathological type (q=0.093-2.169,P>0.05), but related to clinical staging (F=24.59,10.82;q=4.694-11.971；P<0.05). There was significant correlation between the expressions of △Np63 and MDM2 (rs=0.513,P<0.05). Conclusion The expressions of △Np63 and MDM2 may be used as biological parameters reflecting invasion and metastasis of this cancer.

    ［KEY WORDS］ Kidney neoplasms; △Np63; Protooncogene proteins cmdm2; Immunohistochemistry

    肾细胞癌是人类泌尿系统常见的恶性肿瘤，且发病率呈增高趋势。分子生物学研究表明，其能预测肿瘤的生物学行为，为肿瘤的诊断和治疗及术后检测提供新的依据。本研究旨在通过免疫组织化学方法观察△Np63和MDM2蛋白在肾细胞癌中的表达情况及其意义，探讨二者在肾细胞癌发生发展中可能发挥的作用，从而为临床早期判断肾癌的生物学行为和寻求新的治疗途径提供参考资料。现将结果报告如下。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

    实验组76例标本均为我院2000～2006年间手术切除的肾细胞癌标本。其中男46例，女30例；年龄34～85岁，平均56.2岁。病理学分型为：透明细胞癌48例，嗜色细胞癌10例，嫌色细胞癌5例，未分类型及其他13例。ROBSON分期：Ⅰ期16例，Ⅱ期29例，Ⅲ期14例，Ⅳ期17例。有淋巴结转移31例，无淋巴结转移45例。对照组14例肾组织均取自离肿瘤2 cm以上的正常肾组织。

　　1.2  方法

　　1.2.1  主要试剂及来源

　　小鼠抗人MDM单克隆抗体（Dako 公司），△Np63鼠抗人单克隆抗体浓缩液(Santa Cruz公司)，SP免疫组化试剂盒（通用型），DAB显色试剂盒，EDTA抗原修复缓冲液和柠檬酸抗原修复缓冲液（福建迈新公司）。

　　1.2.2  免疫组织化学染色

　　石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，0.01 mmol/L PBS冲洗5 min,共3次。根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复（其中P63为柠檬酸，pH 6.0修复，MDM2为EDTA，pH 8.0修复）。每张切片滴加体积分数为0.03的H2O2双蒸水溶液，室温下放置10 min，用PBS振洗5 min,共3次。滴加正常非免疫动物血清，室温放置10min，甩去多余液体不洗。滴加适当稀释的一抗（P63为1∶100，MDM2为1∶75），于湿盒内室温下放置1 h，PBS振洗5 min,共3次。滴加生物素化二抗，置湿盒内室温放置15 min，PBS振洗5 min,共3次。滴加链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶溶液，置湿盒内室温放置15 min，PBS振洗5 min,共3次。DAB显色，镜下观察，自来水冲洗中止显色。复染核，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阳性对照和阴性对照分别采用已知的阳性切片和PBS代替一抗，步骤与前相同。

　1.2.3  结果判定

　　利用德国Simple PCI 图像分析系统进行灰度测量，将免疫组化染色结果转化为灰度值进行定量分析。每张切片以组织间质空白处入射光的值为定标，在200倍镜下每张切片选取5个视野，分别测定间质灰度和肾癌灰度，取其平均值，作为△Np63和MDM2蛋白表达测定值，测定值＝间质灰度值-癌组织灰度值。

　　1.2.4  统计学处理

　　应用SPSS 11.0统计学分析软件进行统计学处理。组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK法，蛋白表达之间的相关分析采用Spearman法。

　　2  结 果

　　2.1  △Np63、MDM2蛋白的表达

    实验组中△Np63蛋白主要表达于肾癌细胞细胞核，呈棕黄色颗粒，MDM2主要表达于肾癌细胞细胞核；对照组中△Np63和MDM2蛋白少量表达于近曲、远曲肾小管上皮细胞细胞核。

    14例正常肾组织中△Np63蛋白表达测定值为17.67±6.86，MDM2蛋白表达的测定值为14.15±5.24。肾癌组织与正常肾组织中△Np63、MDM2蛋白的表达差异有显著意义（F=28.34、22.57,q=6.471～12.529,P<0.05）；不同病理类型的肾癌组织中△Np63、MDM2蛋白的表达差异均无显著性（q=0.093～2.169,P>0.05）；不同临床分期肾癌组织中△Np63、MDM2蛋白的表达差异有显著性（F=24.59、10.82,q=4.694～11.971,P<0.05）。有淋巴结转移与无转移的肾癌组织中△Np63、MDM2蛋白的表达差异亦有显著意义（F=25.37、13.24，q=7.526、10.835，P<0.05）。见表 1。

　　2.2  △Np63、MDM2之间的关系

    △Np63和MDM2蛋白的表达存在着显著相关性（rs=0.513,P<0.05）。见表 1。表1  肾癌组织中△Np63和MDM2蛋白的表达(略)

　　3  讨 论

    △Np63（缺乏酸性N端反式激活区的截短型p63）是p63基因的一类亚型，对p63的研究表明，p63的结构是p53家族中最为复杂的，p63基因在肿瘤的发生和发展中的作用因其结构不同而不同。它能够参与DNA 结合位点的竞争或直接与p53 或TA p53（酸性N端反式激活区的全长型p63）结合而灭活p53 或TA p53的功能，从而阻止p53 基因和TA 亚型所诱导的细胞周期抑制和发生凋亡[1]。PATTURAJAN等[2]研究表明，△Np63的过表达介导了β链蛋白的磷酸化水平降低，后者又反过来诱导链蛋白核积聚和活化了β链蛋白信号传导途径。正因为△Np63异构体是β链蛋白信号途径的正向调节因子，才使得△NP63异构体具有致癌的特性。本文结果显示，肾细胞癌△Np63的表达明显高于对照组，推测△Np63表现出来的是癌基因的功能，可能具有启动特定突变体肿瘤发生的生物特性，并为癌细胞的存活提供有利条件。△Np63的表达随ROBSON分期增高而增加，有淋巴结转移者△Np63的表达要高于无淋巴结转移者。提示△Np63在肾细胞癌的形成、进展及转移过程中发挥一定的调控作用。本文结果还显示，在不同病理类型的肾癌组织中△Np63的表达差异无显著性，考虑其在肿瘤的发生、发展中所起的作用可能是一样的。

    已有研究结果表明，MDM2与一些肿瘤的发生发展密切相关[3]。MDM2基因最初是由CAHILLYSNYDER等[4]在自发肿瘤鼠Balb/c3T3成纤维细胞系中鉴定出来的。MDM2体内最重要的作用是抑制野生型p53（wtp53）基因的激活转录功能和抗肿瘤活性。其主要通过与p53形成复合物或加速p53的分解，而高水平的MDM2基因产物本身也可以使p53的功能失活，抑制p53的功能,对p53起负调节的作用[5,6]。本文结果显示，肾细胞癌MDM2的表达要明显高于正常对照组，推测MDM2表达过强可封闭p53介导的反式激活作用,使p53功能丧失,导致基因的不稳定及细胞增生,从而表现出癌基因蛋白的作用,参与肿瘤形成。MDM2的表达随ROBSON临床分期增高而增加，有淋巴结转移者MDM2表达要高于无淋巴结转移者，提示MDM2参与肾细胞癌的侵袭和转移。

 总之，△Np63和MDM2都与p53存在密切的联系。而两者在对p53的作用上机制不同，但作用结果是一致的,两者在肾细胞癌的发生和发展中应该是起协同作用的。

【参考文献】  　　[1]LEVRETO M, LAURENZI V D, COSTUNZO, et al. Structure function and regulation of p63 and p73[J]. Cell Death and Differentiation, 1999,6:11461153.

　　[2]PATTURAJAN M, HIBI K, TRINK B, et al. AIS is an oncogene amplified in squamous cell carcinoma[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2000,97(10):54625467.

　　[3]张鲁伟,周荣祥. 膀胱移行细胞癌组织△Np63和MDM2蛋白表达及意义[J]. 青岛大学医学院学报, 2007,43(5)：446448.

　　[4]CAHILLYSNYDER L, YANGFENG T, FRANCKE U, et al. Molecular analysis and chromosomal mapping of amplified genes isolated from a transformed mouse 3T3 cell line[J]. Somat Cell Mol Genet, 1987,13:235244.

　　[5]HU H, XIA S H, LI A D, et al. Association of p63 with proliferative potential in normal and neoplastic human keratinocytes[J]. Invest Dermatol, 1999,113:10991105.

　　[6]OLINER J D, KINZLER K W, MELTZER P S, et al. Amplification of a gene encoding a p53associated protein in human sarcomas[J]. Nature,1992,358(6381):8083.