血液、血制品与人类微小病毒B19的传播

作者：耿彦生， 张印法作者单位：河北大学医学部微生物学与免疫学教研室，河北 保定 071000 【摘要】  人类微小病毒B19(B19病毒)在人群中传播广泛，0.003%～0.6%的献血员带有B19病毒,在病毒血症早期献血员血液中B19DNA含量很高；血浆及血液制品中也经常能检测到B19DNA。通过输血或应用血制品能引起B19病毒的传播，B19病毒感染与多种疾病的发生有关。 【关键词】  血液； 病毒； 疾病传播　　Human parvovirus B19 and the safety of blood and bloodderived products 　　GENG Yansheng, ZHANG Yinfa. 　　Laboratory of Microbiology and Immunology, Center of Medical Science, Hebei University, Baoding  071000, China; Hebei Provincial Center for Health Inspection and Supervision, Shijiazhuang  050071, China　　【Abstract】  Human parvovirus B19 (B19) is a small nonenveloped DNA virus. It is widespread among populations. The prevalence of B19 viremia in blood and plasma donors has been reported to range from 0.003% to 0.6%. Extremely high viremic levels in blood are often found at an early phase of the infection in acutely infected but asymptomatic donors. As a consequence, B19 DNA has been detected at high frequency and high levels in plasma pools and their resulting plasma derivatives. Reports of transmissions attributed to plasma and plasmaderived products are numerous.　　【Key words】  Blood; Viruses; Disease transmission　　人类微小病毒B19属于微小病毒科红细胞病毒属,又称人类红细胞病毒，根据基因组差异B19病毒被分为3个基因型，即基因1型、2型和3型［1，2］。B19病毒体积微小，直径约20～25nm；无脂溶性包膜，病毒衣壳由2种分别称为VP1和VP2的蛋白组成；病毒核酸为含5 596个核苷酸的单链DNA［1］。1975年Cossart及其同事在检测血清样本中乙型肝炎表面抗原时偶然发现了该病毒,因样本编号为B19而得名［3］，此后，英国、日本、法国的学者相继在血液标本中检测到了这种病毒颗粒。B19病毒分布广泛，全球都有流行。    B19病毒感染可引起多种疾病，最常见的疾病为儿童红疹病，俗称“五号病”，是一种比较轻微的疾病；B19病毒感染血液病患者严重时可引起暂时性再生障碍性贫血；孕妇感染可导致流产、胎儿畸形或死胎。此外，B19感染还与关节炎、肝炎、心肌炎、慢性贫血等一些疾病的发生有关［1］。    B19病毒具有红细胞向性，感染机体后侵犯前红细胞，在前红细胞内复制增殖，所以常常可以在血液标本中检测到病毒颗粒。B19病毒除主要由飞沫传播、经呼吸道感染，也可以通过血液、血制品传播而感染，且因为接受输血和应用血液制品的人群常常有血液病、免疫缺陷、或其它疾患存在，病毒感染后更容易导致疾病的发生。因此，血液、血制品感染途径具有更重要的临床意义。

　　1  血液及血液制品中B19病毒的检测及定量    　　检测血液或血液制品中B19病毒，通常先提取病毒DNA，再应用直接核酸杂交或聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)对DNA进行检测，目前对B19DNA进行定性或定量检测主要应用PCR方法。    　　通过终点稀释法可以对血液或血液制品中的B19DNA进行定量，方法简便。即对DNA提取液进行系列稀释(通常为100.5倍稀释),稀释液分别进行PCR，根据PCR结果为阳性的稀释液的最高稀释倍数推算血液或血液制品中病毒DNA的浓度。因为这种方法定量不是很准确，所以称为半定量法，得出的浓度单位为geq/ml(geq就是genome equivalents，即相当于genome copies的数目)。终点稀释法定量的准确度受PCR灵敏度的影响，理论上，当PCR反应的灵敏度为1 copy/reaction时，geq/ml等同于copies/ml。为了提高定量的准确性，终点稀释法定量通常应用灵敏度较高的套式PCR(Nested PCR)。世界卫生组织(world health organization,WHO)于2000年建立了用于B19DNA 核酸扩增检测方法(nucleic acid amplification technology,NAT)的国际标准［4］。应用WHO标准品(1st International Standard 2000,99/800,5×105 IU/vial)的溶液(单位为IU/ml)对终点稀释法的结果进行校正后，浓度可以表示为IU/ml。有报告应用灵敏度为1 copy/reaction的Nested PCR对血浆中B19DNA进行定量，Nested PCR检测样本的灵敏度为4 geq/ml，geq与IU的转换系数为1∶1［5］。

更准确的B19DNA定量方法为实时PCR。通常用已知浓度的B19DNA质粒溶液的10倍系列稀释液(copies/ml)为标准，其测得的Ct值与相应的质粒浓度作标准曲线，根据待测样品所测的Ct值，计算样品中B19DNA的浓度(copies/ml)。同样，用WHO标准对结果进行校正后，则所得浓度为IU/ml。

　　2  献血员的病毒感染率    　　B19病毒在人群中普遍流行，病毒感染多发生于儿童。血清流行病学调查显示，2%～15%的1～5岁儿童体内有抗B19IgG存在；6～19岁儿童IgG阳性率为15%～60%［6］。感染也可以发生在成年，40%以上儿童时期未曾感染B19病毒的成人仍然为易感者。还有报告显示即使曾经感染过B19病毒，也可能再发生感染［7］。成人每年新发感染率在1.5%左右［8］。    　　B19病毒主要通过呼吸道飞沫传播。英国学者对感染过程进行研究，将B19病毒接种于健康成年志愿者的鼻腔，6 d后血液中检测到病毒，病毒血症持续7 d左右［9］。急性感染期，患者血液中病毒含量最高可达1011～1014 copies/ml［10］。成年人B19病毒感染常为隐性感染，或者仅出现轻微发热、头痛等类似感冒的症状。即使处于病毒血症时期，因为没有症状或症状轻微，一般也不引起注意。另有部分病毒感染者经过急性感染期后，病毒不被清除而形成持续感染，这时血液中病毒含量较低，大约在103～107 copies/ml之间，病毒在体内持续时间可长达几个月甚至几年［11］。因此有一定比例的献血员血液中含有病毒，并且可能病毒含量很高。    　　曾有很多关于献血员B19病毒感染率的调查报告，但因为病毒检测方法不同，检测结果难以进行比较。目前普遍应用灵敏度较高的PCR方法检测血液中B19DNA的存在，其灵敏度约在100～102 copies/ml左右。表1中列出了近年来不同国家或地区的调查结果，献血员血液B19病毒阳性率大约在1∶167～1∶5950之间。B19病毒感染呈现流行趋势，而且流行有季节性，通常发生在冬末和初春。流行期间献血员病毒血症阳性率可明显提高，例如法国在1996年3月～1998年5月期间对献血员进行筛查，献血员阳性率为1/5950，而1997年病毒流行期间，阳性率达1/1420［12］。

　　表1  献血员B19病毒血症阳性率（略）

　　Table 1  B19 DNA prevalence in blood donors

　　3  血浆池病毒污染情况    　　血浆池通常由上千份、甚至上万份血浆混合而成作为生产原料，用于血液制品的生产。处于病毒血症时期的献血员，单份血浆病毒含量可高达1011～1014copies/ml，1份含高浓度病毒的血液就足可以使血浆池高度污染。因此没有经过筛选的血液形成的混合血浆池经常能够检出B19病毒，血浆池病毒阳性率很高。德国的Schmidt等应用套式PCR对373个血浆池进行检测，其中222个检测出病毒，阳性率为60%；阳性血浆池中有35%为高度污染，即B19病毒DNA含量≥106 geq/ml［17］。最近Koppelman等应用实时PCR对荷兰166个用于血制品生产的血浆池进行检测，每个血浆池由5 000份没有经过筛选的血浆混合而成，其中92个检出B19DNA，阳性率为56%，阳性血浆池中病毒含量(IU/ml)＞106、106～105、105～104、102～103、阳性～102的血浆池数目分别为11(6.7%)、1(0.6%)、1(0.6%)、29(17.7%)、49(29.9%)［18］。其他文献也报告了血浆池污染情况，血浆池病毒阳性率在13%～85%之间，血浆池病毒含量最高可达1011 copies/ml血液［11］。

　　4  血制品B19病毒污染状况    　　血制品生产过程中通常采用吸附、过滤、溶解去污处理(solventdetergent,S/D)、干热(80 ℃，72 h)、湿热(60 ℃，10 h)等方法清除病毒，这些方法单独或两种以上联合应用可以有效灭活HIV、HBV、HCV等脂溶性包膜病毒。但B19病毒体积微小、没有包膜，抵抗力比较强，生产过程中不能被有效清除。经S/D处理后的血浆池病毒含量与处理前相似，没有经过筛选的血浆池生产的血制品，经常可以检测出B19DNA。Saldanha等［19］检测了不同厂家共75个血浆池，血浆池阳性数为64(85%)，用这些血浆池生产的4种产品第8凝血因子、白蛋白、静脉注射免疫球蛋白和肌肉注射免疫球蛋白阳性批次数/检测数(阳性率)分别为7/7(100%)、3/12(25%)、3/15(20%)、3/4(75%)；血浆池病毒含量为102～109 geq/ml，产品病毒含量略有降低为102～107 geq/ml。

　几乎所有血制品中都有过检出B19病毒的报告，但是比较不同产品病毒检出阳性率，会发现有很大差别。凝血因子，例如FⅧ因子病毒阳性率往往高于其他产品，而免疫球蛋白和白蛋白的阳性率相对较低。Schmidt对多种血制品进行检测，发现病毒阳性率比较高的产品有：FⅧ、前凝血酶复合物、FIX，阳性批数/检测批数分别为79/91、38/43、41/62，病毒含量在102～107 geq/ml之间；抗凝血酶、抗D免疫球蛋白、白蛋白病毒阳性率较低，分别为5/26、3/37、4/51；病毒含量也较低，为102～103 geq/ml［17］。

　　5  输血和应用血制品引起B19病毒感染的危险性    　　B19病毒非流行期间，健康成年人病毒感染率很低，献血员病毒血症阳性率约在1/5950～1/3333之间(表1)，同时输血者和受血者血液中存在的B19病毒中和抗体对病毒的传播有一定阻断作用，因此即使不对B19病毒进行筛选，接受单个献血员的血液或血浆成分引起感染的可能性也很小，仅有几例接受单份血小板、血浆引起感染的报告［20］。但病毒流行时，献血员病毒血症率明显提高，病毒传播的可能性会相应增加。    　　通过池血浆或各种血制品引起B19病毒感染的报告很多，这与池血浆以及血制品有较高病毒污染率一致。流行病学调查显示，应用凝血因子的血友病患者，尤其是儿童，抗B19IgG阳性率高于对照组或正常人群，提示B19病毒可通过凝血因子传播；最近Gaboulaud等［21］将应用血源性凝血因子的血友病儿童与只应用基因重组凝血因子的血友病儿童进行比较，结果前者抗B19IgG阳性率高于后者，进一步证明了通过血源性凝血因子传播B19病毒的危险性。    　　尽管多数情况下B19病毒感染为隐性感染或只引起轻微的临床症状，如儿童红疹病、感冒样疾病，但近几年有越来越多的报告表明B19病毒与一些更严重的疾病有关：贫血、胎儿畸形、关节炎、心肌炎、肝炎、神经系统疾患等。B19病毒感染是否发生疾病以及疾病的严重程度与机体免疫状况有关，血液病患者、先天或获得性免疫缺陷者、孕妇等感染B19病毒后更易引起比较严重的疾病；免疫缺陷者(HIV感染者，先天性免疫缺陷者、恶性肿瘤患者以及接受器官移植者)感染B19病毒还容易形成慢性持续性感染，甚至引起致死性疾病的发生［22］。而频繁接受输血和使用血制品的人群正是这部分危险人群，所以通过输血感染B19病毒可能会导致比较严重的后果。

　　6  B19病毒经血传播的控制    　　血液、血制品B19病毒污染问题日益受到关注，产品管理者、生产者、使用者都希望通过有效的方法去除B19病毒污染以增加血液制品应用安全性。但考虑到B19病毒流行比较普遍，美国食品与药品管理局(food and drug administration,FDA)并没有强制要求对献血员或血浆池进行B19病毒的筛选，只是鼓励使用NAT方法对献血员或血浆池进行检测作为生产过程中的监控手段，以使终产品B19病毒的含量控制在＜10 000 IU/ml的水平［23］。2000年起美国一些主要血制品生产公司主动应用NAT方法检测小型血浆池B19病毒含量。    　　引起B19病毒感染所需的病毒量目前还不清楚。Joan Pehta应用VITEX经过S/D方法处理的血浆进行的研究，19位正常人接受含有高浓度B19DNA(107.5～108.5 copies/ml)的血浆,7人7～10 d出现血清学变化，到3个月时18人有血清学变化，其中14人体内有病毒复制；接受含低浓度B19DNA(100.5～3.5 copies/ml)血浆58位正常人,血清学和病毒DNA检测均为阴性［23］。由此可见，输血感染是否发生与血浆病毒含量有关，血浆病毒含量＜103.5 copies/ml时可能不足以引起感染。基于此研究结果，FDA提出了用于生产血制品的血浆池病毒含量限制在104 geq/ml的建议。如果献血员不经筛选，血浆直接混合成血浆池，则要去除5%～15%的血浆池才能使病毒含量控制在104 geq/ml。目前比较成功的方法是对由100～1 200个单位血形成的小型血浆池进行筛选，如果阳性，再检测更小的血浆池，最后去除高病毒含量的单位血浆［12，24］。最近的研究显示，2001～2004年生产的经过NAT血浆池筛检的抗血友病因子(antihemphilic factor,AHF)产品，B19DNA含量均＜103 geq/ml，81%的产品中甚至没有检出B19DNA。而同样在2001～2004年生产的没有经过NAT筛检的产品，B19DNA阳性率及含量仍然很高，47%的样品B19DNA含量≥103 geq/ml。由此可见，血浆池NAT筛检能够显著降低AHF产品B19DNA的阳性率和含量［25］。

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