PCNA与慢性粒细胞白血病急变关系的研究

　　作者：张冬清 曾宇然　程源山 王佩芬    作者单位：(1.汕头大学医学院第一附属医院检验科，广东 汕头 515041;2.汕头大学医学院第一附属医院血液科，广东 汕头 515041) 　　【摘要】  目的：探讨增殖细胞核抗原(PCNA)与慢性粒细胞白血病(CML)急变之间的关系。方法：采用流式细胞仪技术检测CML患者在慢性期和急变期以及治疗后外周血中的PCNA表达水平。结果：CML慢性期与正常对照组的PCNA表达差异有统计学意义(P<0.01)，在急变期PCNA表达水平显著高于慢性期(P<0.01)，而在治疗达完全缓解后PCNA表达水平显著降低。结论：PCNA表达增高可能是引起CML急变的一个重要原因。

　　【关键词】  PCNA 慢性粒细胞白血病急变关系

　　慢性粒细胞白血病(Chronic granulocytic leukemia，CML)是起源于多能造血干细胞的肿瘤性增生疾病，其自然病程可分为慢性期、加速期和急变期。急变期是慢性粒细胞白血病的晚期，治疗效果差，其发病机制目前是国内外研究的热点。增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA)是促进细胞从G1期进入S期的重要细胞周期调控蛋白，我们采用流式细胞仪技术检测CML患者在慢性期(CP)和急变期(BP)以及治疗后PCNA表达水平的变化，以探讨PCNA在CML急变中的作用。

　　1 资料和方法

　　1.1研究对象

　　25例CML患者，其中慢性期15例，急变期10例，均为我院血液内科住院和门诊随访的病人，经过骨髓细胞形态学、染色体等检查确诊，均符合张之南主编的《血液病诊断及疗效标准》。5例急变患者(急粒变)采用DA标准方案(标准剂量的柔红霉素、阿糖胞苷)治疗获得完全缓解。10例健康人作为正常对照。

　　1.2主要试剂和仪器

　　淋巴细胞分离液(Ficollhypaque，d=1.077)为天津血液研究所产品;FITCPCNA单色荧光标记单克隆抗体和FITCIgG2同型阴性对照购自法国IQ公司;标准荧光微球Flowcheck为Beckman Coulter公司产品;低温高速离心机(德国Heraeus公司);Epicx XL流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)。

　　1.3实验方法

　　1.3.1标本的采集和处理抽取静脉血2ml，用EDTAK2抗凝，充分混匀，采用密度梯度离心得到单个核细胞后用PBS液洗2遍，调整细胞数至1×106·ml-1。

　　1.3.2PCNA染色 取A、B两支试管，各加入细胞悬液10μl，其中A管加入FITC荧光标记的的PCNA单抗10μl，B管加入FITCIgG2作为同型阴性对照;将A、B管室温下避光15min;取出后用PBS液洗两次，200目尼龙膜过滤后上机检测。

　　1.3.3流式细胞仪分析上机检测前采用标准荧光微球Flowcheck校准FL1、SS、FS通道准确性，使各通道CV<2%。细胞的波长在488nm处被氩离子激光激发，FITC的绿荧光通过525nm滤光片收集。每份标本均检测10000个细胞。

　　1.4统计学处理

　　应用Excel统计软件处理实验数据，所有数据以x±s表示，用t检验进行统计分析，以P<0.05为差别有统计学意义，P<0.01为差别有高度统计学意义。

　　2结果

　　2.1PCNA在CML慢性期和急变期中的表达

　　15例CML慢性期患者PCNA的表达为(23.53±6.47)%，与正常对照组比较差异有显著性(P<0.01)，10例急变期患者PCNA表达为(56.45±12.32)%，明显高于慢性期。结果见表1。表1 PCNA在CML和正常对照组中的表达

　　2.2PCNA在CML急变期化疗前后的比较

　　5例CML急变期患者，采用标准化疗方案进行化疗，获得完全缓解时PCNA的表达水平发生了明显的变化，由治疗前的(53.46±12.49)%降为(11.48±5.36)%，两者比较差异有显著性(P<0.01)，而完全缓解时与正常对照组比较差异无显著性(P>0.05)。

　　3讨论

　　CML是一种造血干细胞的恶性克隆性增殖性疾病，由bcr/abl融合基因激活多个信号传导途径(如Ras、P13K、MAPK、JAK/STAT)在CML的发病机制中起关键作用，然而目前这些信号分子的确切功能以及在CML急变中的具体机制尚未肯定[1]。目前，多数学者认为CML急变是涉及多基因、多途径调控异常的复杂过程[2-4]：在分子水平，涉及癌基因、抑癌基因、细胞周期蛋白以及DNA合成、修复和重组蛋白等;在细胞水平，涉及恶性白血病细胞的凋亡受阻、分化障碍以及耐药发生等。

　　PCNA为核内蛋白质，相对分子量为36000，表达于细胞周期的Gl期，在S期达高峰，在G0期表达很少，是促进细胞从G1期进入S期的关键因素，并通过和多种细胞周期调控蛋白相互作用从而在细胞周期调控中发挥重要作用[5];PCNA也是DNA多聚酶辅助蛋白，在DNA复制、修复、重组中发生作用，近年已成为检测细胞增殖活性的新型指标[6]。Michaela等采用RTPCR技术发现：CML患者在发病初期外周血中PCNA基因表达明显增强，提示PCNA表达增高与CML的发病存在一定的关系[7]。本研究采用流式细胞仪技术进一步证实CML患者在慢性期外周血中PCNA蛋白表达水平已开始增高，与正常对照组比较差异有显著性，并且在急变期进一步明显增强;另外，我们观察了CML急变患者治疗前后PCNA表达水平的变化，发现经治疗达完全缓解时PCNA表达水平明显降低，接近正常水平。以上研究说明PCNA表达增高可能是引起CML急变的一个重要原因。

【参考文献】　　1 Deininger MW,Goldman JM,Melo JV,et al. The molecular biology of chronic myeloid leukemia[J]. Blood, 2000, 96(10): 3343-3356.

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　　3 Amin HM,Hoshino K,Yang H,et al. Decreased expression level of SH2 domaincontaining protein tyrosine phosphatase1 (Shp1) is associated with progression of chronic myeloid leukaemia[J]. J Pathol, 2007, 212(4): 402-410.

　　4 Phan CL,Megat Baharuddin PJ,Chin LP,et al. Amplification of BCRABL and t(3;21) in a patient with blast crisis of chronic myelogenous leukemia[J]. Cancer Genet Cytogenet, 2008, 180(1): 60-64.

　　5 Prelich G,Tan CK,Koslura MB. Functional identity of proliferating cell nuclear antigen and DNA polymerase auxiliary protein[J]. Nature, 1987, 326(6112): 517-520.

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　　7 Merkerova M,Bruchova H,Brdicka R. Expression analysis of PCNA gene in chronic myelogenous leukemiacombined application of siRNA silencing and expression arrays[J]. Leukemia Research, 2007, 31(5): 661-672.