习惯性流产的抗凝血酶原抗体IgG、IgM检测的初步应用

    作者：林青，彭维林，李庶甘，唐文吟，张 毅，赵越真，张荣盛，吕华北    作者单位：厦门出入境检验检疫局国际旅行保键中心实验室，厦门 361012     【摘要】  目的 建立人血浆抗凝血酶原抗体（aPT）IgG、IgM 的间接ELISA检测方法，并用于检测原因不明习惯性流产病人。方法 采用人凝血酶原包被微孔板，以碱性磷酸酶标记的抗人IgG、IgM为检测抗体，对35例原因不明习惯性流产患者血浆中的抗凝血酶原抗体IgG、IgM、IgG+IgM进行检测，同时计算其阳性率和优势比（OR，95%可信限）。结果 所建方法线性范围广，稳定性、特异性、重复性较好。原因不明习惯性流产患者血清中抗凝血酶原抗体IgG、IgM、IgG+IgM阳性率分别为14.3%、11.4%和20%，对照组分别为2.5%、2.5%和5%，P值分别为0.073、0.14及0.05。结论 该法是一种较好的抗凝血酶原抗体 IgG、IgM定量测定法。原因不明习惯性流产的aPT较高于正常妇女，可以作为原因不明习惯性流产患者的辅助诊断指标之一。

    【关键词】  抗凝血酶原抗体； 抗磷脂抗体； 流产

    Detection of Antiprothrombin Antibodies IgG，IgM in Patients with Recurrent Abortion

    LIN Qing1，，PENG Weilin2，，LI Shugan1，TANG Wenying2，ZHANG Yi 1， ZHAO Yuezhen2，

    ZHANG Rongsheng1，LV Huabei2

    （1.Xiamen EntryExit Inspection and Quarantine Bureau，International Travel Health Care Center，Xiamen 361012 China；

    2.Quanzhou Children’s Hospital，Quanzhou  362000，China

    Abstract：Objective  To establish an indirect solid phase ELISA  method for  the detection of antiprothrombin （aPT）IgG and IgM，and apply in patients with unknown recurrent abortion.Methods  A indirect ELISA using the purified human prothrombin for plate coating and AKPlabeled goat antihuman IgG or IgM as detection antibody was applied to quantify aPT IgG or IgM levels in plasmas from  35 patients with habitud aboreion（HA）.Their positive rates and odds ratio（OR：with 95% confidence interval，CI）were computed.Results  This method had high precision and good linearity and show good sensitivity，specificity，reproducibility and stabilization.The positive rates of IgG，IgM，IgG+IgMaPT were 14.3%，11.4% and 20%，respectively，with unknown recurrent pregnancy loss，compared with 2.5%，2.5% and 5% in the controls，P value were 0.073，0.14 and 0.05. Conclusion  aPT are more frequently found in patients with HA than in controls.The antiprothrombin assay was validated for the detection of aPT，IgG，IgM，in patients .

    Key words：  Antiprothrombin antibody； Antiphospholipid antibody； Abortion

    抗磷脂抗体（antiphospholipid antibody，aPA）是一族主要针对磷脂结合蛋白的异质性抗体。抗磷脂抗体综合征（antiphospholipid syndrome，APS），是一组与抗磷脂抗体有关的疾病，典型表现有血栓形成和习惯性流产（recurrent abortion）。近年研究表明，低亲和力的抗凝血酶原抗体（antiprothrombin，aPT）与抗磷脂抗体综合征有关[1，2]。我们参考了国外有关文献，在国内首次建立了抗凝血酶原抗体IgG、IgM的ELISA检测方法，并检测了部分原因不明习惯性流产病人。

    1  资料和方法

    1.1  主要试剂与仪器  人凝血酶原纯品和高抗原结合性微孔板Maxisorp分别购自Stago和Nunc公司。牛血清白蛋白（BSA）购自Roche公司。碱性磷酸酶标记的山羊抗人IgG、IgM购自Sigma公司。底物pNPP（pNitrophenyl Phosphate）为BBI公司产品。酶标仪Model 2550为BioRad公司产品。

    1.2  样本及分组

    1.2.1  原因不明习惯性流产组（habitual abortion，HA）病例均有2次以上的自然流产或死胎史，由妇产科医师对患者按诊疗常规进行体检，并进行一些相关的特殊检查，选择已排除了子宫畸形、内分泌异常、染色体异常等明确流产原因的患者，共35例，年龄26～38岁，中位年龄29岁。

    1.2.2  对照组  选择门诊健康、非妊娠妇女体检者40例，无心、肺、肝、肾疾病，无明显妇科疾病，PT及aPTT皆正常，年龄25～39岁，中位年龄28岁。

    采集静脉血，用枸橼酸钠（109 mmol/L）抗凝（1∶9），于22°C，2 500 r/min，离心15 min，制备乏血小板血浆。

    1.3  ELISA定量测定血浆aPT IgG、IgM  以PBS稀释的病人凝血酶原4°C过夜，包被微孔板（10 μg/ml，每孔100 μl）。缓冲液（0.1%TweenPBS）洗涤3次后，封闭液（1%BSA0.1%TweenPBS）室温封闭2 h（每孔200 μl）。加入以封闭液1∶50稀释的待测血浆（每孔100 μl），室温反应1 h。洗涤5次，加入以封闭液1∶20 000稀释的碱性磷酸酶标记的山羊抗人IgG或IgM（每孔100 μl），室温孵育1 h。洗涤5次，加入新鲜配制的底物溶液（pNPP 1 mg/ml，二乙醇胺10 mM，MgCl2 0.5 M，pH 9.8，每孔各50 μl），室温显色后，加3 M NaOH终止反应（每孔50 μl），405 nm读取吸光度（A）值。空白对照孔以封闭液代替待测血浆。我们设定一高滴度aPT IgG或IgM病人的血浆aPT IgG或IgM含量为100％，经系列倍比稀释后建立标准曲线。待测血浆aPT IgG或IgM可通过A值查标准曲线，结果以相当于标定血浆的百分数表示。所有的样本均设立复孔，取其平均值。连续测定40份正常人新鲜乏血小板血浆，以其几何平均值＋2SD作为参考值上限。

    2  结    果

    2.1  标准曲线  以一高滴度aPT IgG或IgM病人的血浆，经系列倍比稀释后建立标准曲线。稀释度范围（1∶1600～1∶50）内，即对应于aPT IgG 或IgM 3%～100%内，aPT IgG或IgM活性的对数值与A 405有着极好的线性关系（R2=0.923）。

    2.2  方法的批内和批间精密度  将2份不同含量的标本一板内重复测定10次，CV分别为4%（平均含量为39%）和6%（平均含量为91%）。同样地，将这二样本连续测定5批，CV分别为6%（平均含量为39%）和7%（平均含量为91%）。

    2.2  两组aPT IgG、IgM、IgG+IgM检测  采用本法分别对原因不明习惯性流产组和正常对照组检测aPT IgG、IgM、IgG+IgM。原因不明习惯性流产组患者血清中抗凝血酶原抗体IgG、IgM、IgG+IgM阳性率分别为14.3%、11.4%、20%，对照组分别为2.5%、2.5%和5%，P值分别为0.073、0.14及0.05，提示原因不明习惯性流产病人的aPT高于正常妇女。在原因不明习惯性流产病人中，aPT阳性的风险高于正常妇女，aPT的 IgG、IgM、IgG+IgM的OR值分别为6.5、7.8、4.9。见表1。表1  35例原因不明习惯性流产病人血清的aPT抗  体病例组阳性比

    3  讨    论

    针对磷脂－蛋白复合物的抗磷脂抗体已经被证明与部分血栓和习惯性流产有关。抗磷脂抗体的检测对于习惯性流产的诊断、预防和治疗均有重要意义[1]。抗凝血酶原抗体（aPT）是抗磷脂抗体家族主要成员之一，其与凝血酶原以低亲和力结合。当磷脂（或类似表面）与凝血酶原结合后，可以富集抗原位点或者使隐藏的抗原位点暴露，从而使得aPT与凝血酶原的结合大大增强，这是aPT发病机制和aPT检测方法的理论依据[2]。

    有多篇文章对aPT和习惯性流产的关系进行了研究，但目前还没有一致的结论[3，4]。这除了与以往发表的报道多数是回顾性研究有关外，缺乏标准化测定方法（样本大小、对照组的选择、统计方法、取样时间）、研究个体存在其它血栓性疾病危险因素等均可以影响结论[2]。由于习惯性流产主要与染色体异常、内分泌失调、解剖学异常和感染有关，只有20％的病例原因不明。近来研究认为免疫因素，如存在抗磷脂抗体，是其重要原因。因此本文选择了不明原因的习惯性流产患者作为研究对象。

    采用ELISA方法检测aPT，可分为单纯以凝血酶原包被和以凝血酶原－磷脂复合物包被二大类。在已发表文章中，前者占绝大多数，为aPT检测的主流方法。目前尚无aPT国际标准品以及标准化的aPT ELISA操作规程[2]。Donohoe等[5]对aPT ELISA的各种条件和材料选用进行较为详尽的研究，为aPT的标准化做了大量的工作。我们据此在国内首次建立了定量测定血浆aPT IgG、IgM的ELISA方法，从结果看，此法线性范围较宽（3%～100%），重复性好，能适应大样本测定，是一种较好的aPT IgG、IgM定量测定法。应用上述方法，我们首次测定了35例不明原因的习惯性流产患者的血浆aPT IgG、IgM含量。原因不明习惯性流产患者血清中抗凝血酶原抗体IgG、IgM、IgG+IgM阳性率分别为14.3%、11.4%和20%，对照组分别为2.5%、2.5%和5%，P值分别为0.073、0.14及0.05；且原因不明习惯性流产患者的aPT较正常妇女略高，故可用以上检测项目，作为对原因不明习惯性流产患者的辅助诊断方案。ReznikoffEtievant等[6]曾对678例习惯性流产病人进行检测，发现aPT（IgG和IgM）总阳性率约占2.8%，但其未将病人进一步细分，因此尚无法将我们的数据与其进行直接比较。同时，我们样本数较少，还需要进行更大规模地调查，以真正了解我国习惯性流产患者中aPT的阳性率。

【参考文献】[1] 谢飞，朱忠勇.抗心磷脂抗体检测和抗磷脂抗体综合征诊断［J］.中华检验医学杂志，2003，26（4）254256.

[2] 谢飞，兰风华.抗凝血酶原抗体和抗磷脂抗体综合征［J］.国外医学：临床生物化学与检验学分册，2003，24（2）：8081.

[3] AMENGUAL O，ATSUMI T，KOIKE T.Specificities，properties，and clinical significance of antiprothrombin antibodies［J］.Arthritis Rheum.2003，48（4）：886895.

[4] MAYUMI，SUGIURAOGASAWARA.Phosphatidylserinedependent antiprothrombin antibodies are not useful markers for highrisk women with recurrent miscarriages[J].Fertility and sterility，2004，82：14401442

[5] DONOHOE S，MACKIE IJ，ISENBERG D，et al.Antiprothrombin antibodies：assay conditions and clinical associations in the antiphospholipid syndrome［J］.Br J Haematol，2001，113（2）：544549.

[6] REZNIKOFFETIEVANT MF，CAYOL V，ZOU GM，et al.Habitual abortions in 678 healthy patients：investigation and prevention［J］.Hum Reprod，1999，14（8）：21062109.