直接凝血酶抑制物的测定及其临床意义

    作者：杨焰，朱 励，杨 锐，魏文宁    作者单位：（华中科技大学同济医学院附属协和医院，武汉 430022）     【摘要】  目的 采用稀释血浆凝血酶时间法（稀释纠正法）检测血浆中特异性凝血酶抑制物，为抗血栓形成治疗提供有效的实验室监测试验。方法 延长的凝血酶时间（TT）用正常人混合血浆作1∶4稀释后作TT测定。结果 稀释纠正法测的直接凝血酶抑制物（direct thrombin inhibitors，DTIs）浓度与TT有良好的相关性（r＝0.9569），可测最低DTIs浓度为8.0×10－3 μg/ml，测得凝血酶抑制药物阿加曲班治疗患者DTIs血浆浓度为118.2±20.78×10－3 μg/ml，不明原因轻度出血异常、急性白血病患者也存在不同程度的DTIs。结论 稀释纠正法TT测定对DTIs有较高的特异性和敏感性，是凝血酶抑制物类药物治疗血栓性疾病有价值的实验室监测指标。

    【关键词】  凝血酶抑制物； 稀释凝血酶凝固时间； 抗血栓治疗

    The Clinical Value of Direct Thrombin Inhibitors Testing

    YANG Yan，ZHU Li，YANG  Rui，WEI Wenning

    （The Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan  430022，China）

    Abstract： Objective  To detect specific thrombin inhibitors with a plasma diluted thrombin time and find an effective method for laboratory monitor of anticoagulant and thrombolytic therapy.Methods  Patient samples were 1∶4 dilutions with normal plasma and the diluted thrombin time was examined by ACL9000.Results  The direct thrombin inhibitors （DTIs）detected by diluted thrombin time were associate with the thrombin time（r=0.9569），the lowest density of DTIs was 8.0×10-3μg/ml，the DTIs density of patients spiked with argatroban was （118.2±20.78）10-3μg/ml，the DTIs were also detected in patients with unknown bleeding and acute leukemia.Conclusion  Detecting DTIs with a plasma diluted thrombin time is with high specificity and sensitivity，and it is a valuable index for laboratory monitor of anticoagulant and antithrombotic treatment.

    Key words：  Thrombin Inhibitor；  Diluted thrombin time；  Antithrombotic treatment

    凝血酶的形成是凝血、纤溶系统启动的核心，在出血和血栓形成中起着重要作用，因此对抗凝血酶活性的检测有着较重要的临床价值。既往研究显示，用活化部分凝血活酶时间（aPTT）、凝血酶凝固时间（TT）方法检测抗凝血酶活性受到较多因素影响；如狼疮抗凝物、类肝素类物质以及纤维蛋白原含量等[1]。本文介绍用稀释血浆凝血酶时间法（稀释纠正法）测定直接凝血酶抑制物（DTIs），并对应用抗凝血酶药物阿加曲班（argatroban）肝素治疗、aPTT延长、纤维蛋白降解产物D二聚体（DD）增高、纤维蛋白原含量异常等临床病例进行了DTIs检测。

    1  资料与方法

    1.1  研究对象  健康正常人混合血浆，取凝血相关检测正常者22份乏血小板血浆（PPP）混合，8只家兔混合PPP分装-40℃保存待测。实验室检查凝血酶时间（TT）延长受检者86例，中位年龄48.8（20～76）岁，均为我院门诊及住院患者，其中未明原因出血患者24例（临床多表现为皮肤黏膜出血、血尿、牙龈出血），急性白血病（AL）42例，下肢静脉血栓形成（DTV）抗栓治疗组患者20例。

    1.2  试剂  阿加曲班（argatroban，达贝）天津药物研究院药业有限公司产品，NO：07.10.05。凝血酶、活化部分凝血活酶时间（aPTT）等试剂由DADE BEHRING公司提供。

    1.3  仪器   CA7000（日本sysmex）全自动血凝仪。

    1.4  方法  取凝血酶凝固时间（TT）延长之PPP用正常混合PPP做1∶4稀释，取稀释后血浆上机检测TT、aPTT、蕲蛇酶时间、纤维蛋白原（Fbg）、    D二聚体（DD）、抗凝血酶活性（AT：A）。

    1.5  统计学处理  SPSS 16.0软件t检验，P＜0.05为差异有显著意义。

    2  结    果

    2.1  DTIs 标准曲线制备  将阿加曲班用正常混合血浆稀释成终浓度为8.0、16.0、31.25、62.5、125、250×10-3μg/ml血浆，同时以生理盐水为零点对照，并将凝血酶时间调整至使0浓度样本凝固时间为10.0±1.0 s，上机检测TT、aPTT。结果显示TT与aPTT与阿加曲班浓度有良好的相关性，且TT较aPTT反应敏感。见图1

    2.2  家兔混合血浆DTIs试验   TT延长家兔PPP与正  常人PPP按不同比例稀释，上机检测DTIs。结果见表1。 表1  不同比例正常人PPP对TT延长家兔PPP纠正结果 表1显示不同比例纠正结果虽有TT缩短趋势，但差异无显著意义（P＞0.05）。提示家兔血浆存在DTIs。

    2.3  将临床病例分为未明原因出血组、急性白血病组、血栓病治疗组延长的TT、aPTT按上述方法进行纠正检测。结果见表2。表2  临床各组病例TT延长纠正结果*由DTIs标准曲线查得凝血酶抑制物含量。表2结果显示，受检86例TT延长者51.2％未被正常人PPP纠正，48.8％被纠正，提示血浆中有凝血抑制物存在，其中DTV治疗组未被纠正者占90.0％，未明原因出血组占45.8％，AL组占35.7％提示血浆中有DTIs存在。表3  临床各组病例TT延长未被纠正组其他实验指标异常情况*由DTIs标准曲线查得凝血酶抑制物含量。表3结果提示未被纠正组TT延长与aPTT异常有较高的一致性。

    2.4  TT延长纠正和未纠正其他实验指标异常的比较结果  见表4、图2。 表4  TT延长纠正和未纠正其他实验指标异常的比较系列1 纠正组，系列2 未纠正组    图2显示所测未被正常人血浆纠正的占51.2％，有4.76％可由蕲蛇酶纠正（提示肝素类物质增多），Fbg降低占9.52％，DD增高占14.3％；被纠正的占48.8％，其中Fbg降低占65.9％，DD增高占56.8％，AT：A降低占43.2％。由此可看出，因DD增高、肝素类物质增多引起的TT延长多能由正常人血浆纠正；未纠正组由上述原因引起的TT延长能正常人血浆纠正的比例明显减少，提示对DTIs测定有较高的敏感性。

    3  讨    论

    3.1  直接凝血酶抑制物测定方法  该方法由Love等[2]首先建立，并认为是抗血栓治疗监测的理想实验指标。本资料也显示稀释纠正法与特异性抗凝血酶治疗药物阿加曲班有良好的量效关系。由药物稀释曲线可知稀释纠正法TT与血浆中药物浓度有明显的相关性（r＝0.987），可检查最低浓度为8.0×10－3μg/ml，提示该方法有很高的敏感性。TT延长未纠正组与被纠正组其他试验指标结果对比显示，当血浆中Fbg、ATA减低，DD、类肝素物质增高等引起TT延长因素存在时多数可由正常人血浆纠正，反之存在DTIs时TT延长则多数不能被纠正。aPTT对DTIs也有一定的敏感性，但据Love等报道，aPTT明显受狼疮抗凝物、类肝素类物质增多的影响。本文结果也显示，aPTT延长能为正常人血浆纠正的占36.4％，比未纠正组21.4％要高（表4），同时检出健康家兔有DTIs存在可能是异种蛋白抗体所致。上述实验数据表明稀释纠正法对DTIs有较高的特异性和敏感性。

    3.2  直接凝血酶抑制物测定的临床意义  抗凝血酶治疗的实验室监测对于保证治疗安全和效果有重要的临床意义，近年来已收到广泛关注[3，4]。阿加曲班类药物是一种直接针对凝血酶的抑制剂，其可逆地与凝血酶活性位点结合，其抗血栓作用不需要抗凝血酶的参与，对凝血酶的抑制有很高的选择性，因此在抗血栓治疗中必须进行有效地监测才能保证其有效、安全性。aPTT、TT是以往常用的实验室监测试验，但因上述提到的诸多影响因素，使其应用价值受到限制。临床不明原因轻度出血异常也是该领域备受关注的课题[5]。

【参考文献】[1] 王振义，李家增，阮长耿.血栓与止血基础理论与临床[M].第二版．上海：上海科学技术出版社，1996：871941.

[2] LOVE EJ，CHRIS FERRELL，CHANDLER LW. Monitoring direct thrombin inhibitors with a plasma diluted thrombin time［J］.Thromb Haemost，2007，98：234242.

[3] YOUNG G，TARANTINO MD，WOHRLEY J.Pilot dosefinding and safety study of bivalirudin in infants ＜6 months of age with thrombosis［J］.J Thromb Haemost，2007，5（8）：16541659.

[4] WIENEN W，STASSEN JM，PRIEPKE H.Antithrombotic and anticoagulant effects of the direct thrombin inhibitor dabigatran，and its oral prodrug，dabigatran etexilate，in a rabbit model of venous thrombosis［J］.J Thromb Haemost，2007，5（6）：12371242.

[5] 沈 迪，沈 霖，王爱莲，等. 消瘀止血片治疗未明原因多部位出血伴血小板聚集缺陷104例临床观察[J].中国中西医结合杂志，，1997，17（5）：280282.