一种总体止血能力的检测方法及其应用

作者：吴锋    作者单位：西安交通大学医学院, 西安,710061 　　An Overall Haemostatic Potential Assay and its Clinical Practice

　　WU Fen, MA Xi, ZHUANG Guihua , CHE Jin

　　（Research Unit for Experimental Hematology, Faculty of Medicine, Xi’an JiaoTong University, 710061,Xi’an, China)Abstract:   Objective  To establish an overall haemostatic potential assay and evaluate its ability to indicate the hypercoagulable state and the coagulopathy.Methods  In the present of plasminogen activator(UK) the plasma clotting was triggered by the low concentration of tissue factor. The time course of fibrin formation and the fibrin degradation was measured by a spectrophotometer at 340 nm. The opacity curve obtained for coagulationfibrinolysis was processed by a personal computer. The related parameters including the overall haemostatic potential(OHP), overall coagulation potential(OCP) and the overall fibrinolysis  potential(OFP)were established. Results  It was found that OHP and OCP were increased and /or OFP was decreased in the patients of cancer, normal pregnancy and coronary heart disease. The significant decreased OCP and OHP was found in the hemophilia patients.Conclusion  It is therefore concluded that the overall haemostatic potential assay may indicate the body haemostatic balance. It is not only used for evaluation of the hypercoagulable state , also for the screening of coagulopathyKey words:  Tissue factor;  Plasminogen activator;  Overall haemostatic potential;  Hypercoagulable state;  Coagulopathy 

　　机体止血功能增强会导致高凝状态和/或血栓形成趋向。造成高凝状态的成因十分复杂，涉及血管功能和凝血成分改变、抗凝血功能缺乏或凝血因子突变（导致凝血功能增强）、凝血因子水平获得性升高和/或纤溶活性减低。但其基本变化是止血功能增强。虽然评价止血的试验方法众多，但在现行的试验类型当中，没有一个单独的止血试验能够反映高凝状态，甚至多个参数的变化，也不足以确定诊断，致使高凝状态的诊断困难。我们参考［1,2］文献，建立了一种总体止血能力检测方法。该法是在纤溶酶原激活物UK存在下，以低浓度组织因子激活血浆，在340 nm测量纤维蛋白形成和降解过程中的吸光度变化，从获得的所谓凝血纤溶曲线求出总体止血能力（overall haemostatic potential，OHP）、总体凝血能力（overall coagulation  potential，OCP）和总体纤溶能力（overall fibrinolysis potential，OFP）等参数。初步观测发现，恶性肿瘤、妊娠和冠心病存在高凝状态，表现在OHP和 OCP值增高；血友病病人存在凝血障碍，OHP和 OCP值明显降低。现报道如下。

　　1  资料与方法

　　1.1  实验材料  组织因子（凝血活酶）由DADE BEHRING 提供；尿激酶(UK)购自辽宁天龙药业公司；因子Ⅷ缺乏血浆购自太平洋诊断试剂公司。聚乙烯二醇（PEG6000）及Tween80等化学品均属分析纯等级。

　　1.2  研究对象  36例健康体检人员，男 18例，女18例，年龄25～60岁；108例病人，其中包括冠心病23例，妊高症18例，恶性肿瘤45例，年龄 26～64岁；血友病 22例，年龄为2～46岁，分别来自西安交通大学第一、第二医院和陕西省肿瘤医院。

　　1.3  标本采集与制备  空腹采集静脉血，按血液与抗凝剂（0.13 mol/L拘橼酸钠）9∶1比例制备抗凝血，再以3 000 r/min离心血样15 min，吸取血浆备用。

　　1.4  检测方法

　　1.4.1  。总体止血能力（OHP）测定  OHP测试系统是我们根据纤维蛋白原转变动力学原理设计研制的（另文报道）。该测试系统应用微机完成对血浆纤维蛋白形成与降解过程的实时监测，直观显示和记录整个反应过程的数据，绘制反应曲线，求出OHP、OCP和OFP等指标，并可进行检验报告单、反应曲线和数据打印。实际测试时，调节光度仪波长到340 nm，设置测试时间30 min，以缓冲液调节测试零点。预先在比色皿中加入待检血浆100 μl和适量UK（用以激活血浆纤溶酶原），随后加入900 ul含组织因子的缓冲液（0.1mmol/L Tris、20g/L  PEG6000、10g/L Tween80、5 mmol/L CaCl2，pH 7.35），立即混匀，然后置于测试孔内，按动测试键。仪器自动监测和记录纤维蛋白形成和降解过程的吸光度变化，计算反应曲线内面积（根据总吸光度计算），求出OHP。

　　1.4.2  总体凝血能力（OCP）测定  采用与上述OHP测试相同的反应体系、实验条件和操作方法，但反应体系不含纤溶酶原活化剂UK，监测30 min内纤维蛋白形成过程的吸光度的变化，计算反应曲线以内总吸光度，求得OCP。

　　1.4.3  总体纤溶能力（OFP）判断  按下列公式计算：OFP=（OCP-OHP）/OCP×% 。

　　1.4.4  因子Ⅷ测定  采用标准一期法测定。

　　1.5  统计学方法  成组t检验及相关分析采用SPSS 12.0软件。

　　2  结    果

　　2.1  不同浓度组织因子对OHP的影响  OHP测试要求全面激活凝血反应，但通常的凝血激活物并不符  合这一要求。例如，以常规浓度的组织因子（TF）激活血浆时，凝血沿外源凝血途径运行（凝血酶原时间），而绕过内源凝血途径，若以部分凝血活酶激活血浆时，凝血则沿内源凝血途径运行。很早我们就注意到［3］，低浓度的TF可以同时激活内源凝血途径。如图1所示，在相对高浓度的TF存在下，正常对照血浆与因子Ⅷ缺乏血浆的OHP值（曲线以内面积）并无明显差别。但是，当TF浓度降至1/20 000稀释度以下时，与对照血浆比较，因子Ⅷ缺乏血浆的OHP值明显降低。而用正常血浆重建因子Ⅷ缺乏血浆后，OHP值得到恢复（结果未显示）。说明这是由于因子Ⅷ缺乏而导致因子Ⅷ反馈活化环节受阻，所生成的少量凝血酶不能够通过该机制放大凝血酶的生成，从而减缓纤维蛋白原转变率，导致OHP值降低。这一结果清楚地表明，在我们的实验条件下，以低浓度TF激活血浆时，凝血反应开始依赖内源凝血途径。换言之，低浓度TF可以同时激活内、外源凝血途径。因此，选择1/20 000稀释度的TF作为凝血激活物。

　　2.2  不同浓度UK对OHP的影响  在试验体系中加纤溶酶原激活物，激活纤溶系统，用以测定纤溶能力。我们采用UK作为纤溶酶原激活物。选择UK浓度的标准是，能使形成的纤维蛋白在规定的30 min内完全降解，同时对纤维蛋白原不产生明显影响。从图2可以清楚地看到，当UK浓度小于30 u/ml时，所生成的纤维蛋白不能被有效降解；UK浓度大于50 u/ml时，虽然纤维蛋白能够被迅速降解，但纤维蛋白的形成却明显降低。说明较高浓度的UK对纤维蛋白原有降解作用，不宜用作测试。因此，选择UK浓度40 u/ml作为纤溶激活物。

　　2.3  不同浓度聚乙烯二醇对OHP的影响  凝血反应过快或过慢，都会影响测试的敏感性。根据测算，适宜的凝血反应延滞时间应当在3～5 min范围内。因此，在OHP测试体系中加入一定量聚乙烯二醇6000（PEG6000），用以调节凝血反应的延滞时间（lag time）和提高测试的敏感性。加Tween80则用于消除PEG60000引起的非特异性沉淀，起稳定相作用。根据对不同浓度PEG60000的筛选结果，保持反应延滞时间在3～5 min的PEG6000浓度为20 g/L。

　　2.4  凝血因子对OCP和OHP的影响  我们以因子Ⅷ缺乏血浆（因子Ⅷ含量1%）为实验材料，观察了凝血因子对OCP和OHP的影响。如图3所示，在因子Ⅷ缺乏血浆中加入不同量的因子Ⅷ（加不同量的正常混合血浆），随着因子Ⅷ含量增加（相对活性0、1.625、3.125、6.25、12.5、25、50、100），OCP值逐步增大，并伴随着反应延滞时间缩短。类似结果也见于OHP。表明OCP和OHP都能反映凝血障碍。

　　2.5  重复性、精确性测试  取正常混合血浆100 μl，加40 u/ml UK（终浓度），再加900 μl含TF的缓冲液（0.1 mmol/L Tris、20 g/L  PEG6000、10 g/L Tween80、5 mmol/L CaCl2，pH 7.30），在340 nm测试OHP。OCP测试与上述实验体系相同，但反应体系不含UK。测得OHP变异系数为 3.5%（n=10），OCP为2.8%（n=10）。测得正常人（n=36）OCP、OHP和OFP值分别为 4.84±1.40、2.37±0.91和51.27±9.66。正常混合血浆OHP、OCP及OFP测试图如图4所示。其中OCP等于OHP光密度面积加OFP光密度面积。

　　2.6  不同病人OHP、OCP和OFP检测结果： 恶性肿瘤、妊娠、冠心病和血友病病人OHP、OCP和OFP测试结果如表1所示。与对照组比较，恶性肿瘤、妊娠、冠心病病人的OCP和OHP 值均明显增高，而OFP值减低，并伴随纤维蛋白生成反应延滞时间缩短（结果未显示）。表明此类病人普遍存在高凝状态和/或纤溶活力降低。血友病病人OCP和OHP值明显降低, OFP值也有所降低。说明血友病存在严重凝血障碍。表1  不同病例OHP、OCP和OFP测试结果

　　3  讨    论

　　长期以来，人们一直在努力，试图建立一种能够反映总体止血能力的试验，用于评价机体止血平衡。早在1995年，Hemker等［4］就建立了所谓内源凝血酶能力（endogenous thrombin potential，ETP）测定方法，用于评价机体凝血平衡。该法是以低浓度TF和磷脂混合物激活血浆，用人工发色底物测定凝血酶生成，根据凝血酶生成图（thrombogram）测算ETP。ETP增高见于血栓前状态和/或高凝状态病例，包括抗凝血酶缺乏、凝血酶原高度表达（凝血酶原A20210C）、蛋白C/蛋白S缺乏、因子Ⅴ Leiden突变和口服避孕药个体；ETP减低见于各种凝血障碍性疾病。ETP法采用TF和磷脂混合物，能够全面激活凝血过程，能够反映机体某些血栓前状态和凝血障碍，但该法以凝血酶生成为监测终点，所以只能反映凝血酶形成以上阶段的凝血功能，并不能反映凝血的全部时相（如纤维蛋白原转变成纤维蛋白），也没有包括纤溶过程，因而还不能说该法能反映总体止血功能。1999年He等［1］报道了一种OHP测定方法。该法是在纤溶酶原活化剂tPA存在下，用小量凝血酶激活血浆，直接观测纤维蛋白形成和降解过程。虽然这种方法能够观测到凝血和纤溶过程，大体上可以反映凝血和纤溶系统功能，但该法以凝血酶作为凝血激活物，直接使纤维蛋白原转变成纤维蛋白，忽视了因子Ⅷ和其他诸凝血成分相互之间反应对凝血的推动作用。实际上，这种方法很难真实地或者全面地反映凝血状况。 TF被公认是最重要的凝血激活物。我们很早就发现［3］，用低浓度TF激活甲型（缺乏因子Ⅷ）或乙型血友病（缺乏因子Ⅸ）血浆时，所检测到的凝血酶生成量与正常人相比异常减低。用纯化的因子Ⅷ和因子Ⅸ重建血友病血浆后，凝血酶的生成量即恢复正常。证明了由低浓度TF启动的凝血依赖内源凝血途径。这一结论在此项研究中得到进一步印证。当以低TF浓度（1/2 000稀释度以下）激活血浆时，与对照血浆比较，因子Ⅷ缺乏血浆的OHP值明显降低。这是由于因子Ⅷ缺乏而导致因子Ⅷ反馈活化环节受阻，所生成的小量凝血酶不能够通过该机制放大凝血酶的生成，从而减缓纤维蛋白原转变率和OHP值降低。说明在我们的实验条件下，低浓度TF可以同时激活内、外源凝血途径。低浓度TF适合于OHP测定。UK是纤溶酶原激活物之一。但UK属于非特异性纤溶激活物，除可以激活与血凝块（纤维蛋白）结合的纤溶酶原，还可以激活与纤维蛋白原结合的纤溶酶原。因此，UK不仅会使纤维蛋白降解，也会使一定量的纤维蛋白原降解。从理论上讲，UK并不一定适合OHP测试。是否能够通过减少UK剂量而降低对纤维蛋白原的降解作用呢？从对UK浓度筛选的结果表明，在我们的实验条件下，较低浓度UK对纤维蛋白原并没有明显的降解作用，在40 u/ml UK存在下，纤维蛋白在30 min几乎被完全降解，而纤维蛋白原的转变（纤维蛋白形成）并没有受到明显影响。证明用较低浓度UK作为纤溶激活物可以取得了与tPA类似的结果［2］，同样适合于OHP测定，这将大大地降低试验成本。在上述研究的基础上，并通过对诸实验条件的研究，我们建立的总体止血能力检测方法。本法是根据纤维蛋白原转变的动力学原理［5］，在纤溶酶原活化物UK存在下，以低浓度TF激活血浆，在340 nm实时监测纤维蛋白形成与降解过程中的吸光度变化，直观显示和记录整个反应过程的数据，绘制反应曲线，并根据获得的凝血纤溶图，求出OCP、OHP和OFP。本法具有很高的重复性，OCP和OHP重复性测定的变异系数分别为2.8%（n=10）和 3.5%（n=10）。初步观测发现，恶性肿瘤、妊娠和冠心病普遍存在高凝状态，表现在OHP和 OCP值增高，同时伴随OFP值降低；血友病病人OHP和 OCP值明显降低，存在严重的凝血障碍。表明本法能够反映机体止血平衡，不仅可作为高凝状态的检测手段，还可用作凝血障碍的筛选手段。

【参考文献】[1] HE S, BREMME K, BLOMBACK MA. Laboratoty method for determination of overall haemostatic potential in plasma I. Method design and preliminary results[J]. Thrombosis Research,1999，96:145156.

[2] HE S, AUTOVIC A ，BLOMBACK M. A. Simple and rapid laboratoty method for determination of haemostatic potential in plasma. Ⅱ.Modifications for use in routine laboratory and research work[J]. Thrombosisi Research，2001，103:355361.

[3] MA XI, BEGUIN S，HEMKER HC. Importance of factorⅨdependent prothrombinase formationthe josso pathway in clotting plasma[J]. Haemostasis, 1989，1930119308.

[4] HEMKER CH,BEGUIN S. Thrombin generation in plasma: its assessment via the endogenous thrombin potential[J]. Throm Haemost，1995，74:134138.

[5] 马西. 血浆纤维蛋白原功能自动检测系统[J]. 血栓与止血杂志，1998,5(4)：181185.