PPARɑ激动剂抑制脂多糖诱导的单核细胞组织因子表达和促凝血活性

作者：饶 绘，魏文宁    作者单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院，武汉 430022     【摘要】  目的 研究过氧化物酶体增殖物激活受体ɑ(PPARɑ)激动剂(非诺贝特)对细菌脂多糖（LPS）诱导的单核细胞株THP1细胞的组织因子（TF）表达和促凝血活性(PCA)的影响。方法 用非诺贝特预处理THP1细胞，分别用流式细胞术(FCM)和改良组织因子凝血时间法（TiFaCT）检测LPS刺激下THP1细胞的TF蛋白表达水平和TFPCA。结果 非诺贝特抑制LPS诱导下THP1细胞的TF蛋白表达上调，并以浓度依赖的方式抑制LPS诱导下的TFPCA增加（F=62.79，P＜0.05）。 50 μmol/L和100 μmol/L浓度的非诺贝特分别使TFPCA下降到LPS组的29%和25%。结论 PPARɑ激动剂抑制LPS诱导的单核细胞TF蛋白表达和TFPCA，这可能是PPARɑ激动剂减少动脉粥样硬化血栓形成并发症的机制之一，并在血栓性疾病的防治中具有潜在的临床价值。

    【关键词】  组织因子； 过氧化物酶体增殖物激活受体ɑ； 非诺贝特； 血栓形成

    PPARα Agonist Inhibits LPSInduced Tissue Factor Expression and Procoagulant

    Activity in Monocytes

    RAO Hui,  WEI Wenning

    (Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan  430022, China)

    Abstract:   Objective  To investigated the effects of peroxisome proliferatorsactivated receptorα(PPARα) agonist （fenofibrate） on the expression and procoagulant activity (PCA) of tissue factor (TF) induced by Lipopolysaccharide (LPS) in THP1 cells. Methods   THP1 cells were pretreated with fenofibrate for definite time. LPS induced TF protein levels and TFPCA were measured by flow cytometry and modified Tissue Factor Clotting Time (TiFaCT) respectively. Results   Fenofibrate inhibited TF expression, decreased TFPCA in a concentrationdependent manner in LPSstimulated THP1 cells (F=62.79, P<0.05). Compared with the TFPCA of LPSstimulated THP1 cells, pretreated with 50 μmol/L or 100 μmol/L fenofibrate on THP1 cells, TFPCA were decreased to 29% and 25% respectively. Conclusions   These data indicate that PPARα agonist inhibits LPSinduced TF expression and TFPCA, which may be one of the mechanisms of antiatherosclerotic thrombosis effects of PPARα agonist，and may be involved the precaution and therapy of thrombosis.

    Key words：  Tissue factor；  Peroxisome proliferatorsactivated receptorα；  Fenofibrate；  Thrombosis

    组织因子（TF）即凝血因子Ⅲ，是机体内活性最强的促凝物质之一。单核细胞是目前已证实可在体外被脂多糖(LPS)、细胞因子等诱导表达TF的细胞。单核细胞TF表达与败血症休克、癌症和免疫炎性疾病等多种病理状态下的血栓形成相关，尤其在动脉粥样硬化(AS)血栓形成并发症中起关键作用。在AS形成和发展的过程中，单核细胞迁移、分化、吞噬脂质，形成了斑块内富含TF的坏死核。而TF参与血管平滑肌的迁移和增生，促进了斑块失稳。当斑块破裂后，暴露出的TF易诱发血栓而致急性冠脉综合征(ACS)。而且，在对ACS病人进行早期溶栓、介入等治疗时都可能使内膜TF再次暴露，诱发血栓性再闭塞，治疗中脱落的含TF斑块残片还可能引起远端血管栓塞造成严重的临床后果。有报道TF的内源性抑制物——组织因子途径抑制物（TFPI）在临床实验中的治疗效果并不理想[1]。因此，寻找有效调控贯穿于AS病程全过程的单核细胞TF表达的药物具有重要的临床价值。近年来的研究显示，服用降血脂的过氧化物酶体增殖物激活受体 (PPAR)ɑ激动剂——贝特类药物可减少AS血栓形成并发症的发生率［2，3］，是否PPARɑ激动剂能调控单核细胞TF表达和促凝血活性(PCA)。本研究初步探讨了PPARɑ激动剂(非诺贝特)对LPS诱导的单核细胞株THP1 细胞TF蛋白表达和TFPCA的影响，评价了PPARɑ激动剂在防治血栓形成性疾病中的潜在机制。

    1  资料与方法

    1.1  材料  人类单核细胞白血病细胞株THP1购自武汉大学细胞典藏中心。LPS（Sigma公司，L3129），非诺贝特（Cayman公司），TFPI(ADI公司)，组织凝血活酶(Helena公司)，鼠抗人TFFITC单抗（ADI公司，4507CJ），鼠IgG1FITC(美国BD公司)。主要仪器：流式细胞仪(FACS,美国BD公司), BOCA血凝仪(中泰公司)。

    1.2  方    法

    1.2.1  THP1细胞培养与处理  THP1细胞培养于加有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，37℃，5%CO2培养。细胞经50 μmol/L非诺贝特预处理3 h，加入LPS(10 μg/ml)，37℃孵育4 h测定TF蛋白表达；不同浓度的非诺贝特(0、10、50、100 μmol/L)预处理THP1细胞3 h，加入LPS孵育4 h测定TFPCA。所有实验均重复2次，结果取均值。用台盼蓝拒染试验观察处理前后的细胞活性。

    1.2.2   流式细胞术(FCM)检测THP1细胞表面TF蛋白表达  处理后的细胞用1%多聚甲醛避光固定30 min，洗涤后取50 μl细胞悬液(106/ml)加5 μl鼠抗人TFFITC单抗，使用鼠IgG1FITC作为同种型对照，4℃避光孵育30 min，PBS洗涤并重悬细胞，上流式细胞仪进行检测。

    1.2.3  改良组织因子凝血时间法（Tissue Factor Clotting Time，TiFaCT）标准曲线的制备及THP1细胞TFPCA的检测  据文献报道[4],绘制凝血时间活性的半对数曲线。方法为在BOCA血凝仪的反应杯中加入组织凝血活酶100 μl、正常新鲜混合血浆100 μl和磁珠1粒，37℃预温3 min，加入0.025 mol/L CaCl2100 μl，同时启动血凝仪计时，以正常新鲜混合血浆凝固时间为20 s的组织凝血活酶浓度确定为1 000 u(任意单位，AU)。将此组织凝血活酶进行10倍的连续稀释至0.01 AU。绘制凝血时间活性的半对数曲线即为标准曲线(n=3)。曲线的回归方程Y=3.210.02X，r=-0.997。处理后的THP1细胞(106/ml)经反复冻融3次以裂解细胞。在BOCA血凝仪的反应杯中加入细胞冻融液100 μl同上测定，得到的凝血时间经查标准曲线换算得到TFPCA。将TFPI(5 ng/ml)与处理后的细胞悬液(106/ml)混匀，反复冻融3次后同法测定细胞冻融液的PCA，比较加和未加TFPI两组的结果，以评价改良TiFaCT法对TFPCA的特异性。

    1.2.4   统计学处理  所有数据采用x±s表示，使用SPSS 13.0软件分析处理。不同处理条件下的均数比较采用单向方差分析，多重比较使用LSDt检验法。P<0.05为差异有统计学意义。

    2  结    果

    2.1  THP1细胞的TF蛋白表达水平变化  无LPS刺激时，THP1未见明显的TF蛋白表达。LPS刺激4 h后，表达TF蛋白的阳性细胞数(%Gated)增加了约25倍，50 μmol/L非诺贝特预处理3 h后加LPS组的%Gated下降到LPS组的46%(P<0.05）。见图1。

    2.2  非诺贝特对LPS诱导的THP1细胞TFPCA的影响  不同浓度非诺贝特对LPS诱导的THP1细胞TF PCA的影响呈浓度依赖模式(表1)。LPS处理THP1细胞可使其TFPCA上升达12倍，10 μmol/L的非诺贝特预处理对LPS刺激的TFPCA无明显影响， 而50 μmol/L和100 μmol/L的非诺贝特则使TFPCA分别下降到LPS组的29%和25%， 使用TFPI后的TFPCA仅为LPS组的4%( P<0.05) 。而在未用LPS诱导条件下，非诺贝特单独使用时对TFPCA无明显影响；100 μmol/L与50 μmol/L浓度的非诺贝特预处理后加LPS两组间比较亦无统计学差异(P>0.05)。表1  不同浓度非诺贝特对LPS诱导的THP1细胞促凝血活性的影响注:与LPS未刺激组相比，*P<0.05；  与LPS刺激组相比，#P<0.05；  与50 μmol/L非诺贝特加LPS组相比，△P>0.05

    3  讨    论

    过氧化物酶体增殖物激活受体ɑ（PPARɑ）的药理性配体——非诺贝特是临床常用的降血脂药物，其降脂作用主要通过激活PPARɑ而实现。除降脂作用外，非诺贝特还具有抗炎、抗氧化、改善内皮功能和抗血栓等多种生物学作用［5］。最近的研究显示，服用贝特类药物可减少AS血栓形成并发症的发生率［2，3］，其机制可能与非诺贝特的抗血小板聚集作用有关，而且非诺贝特与维生素K竞争血浆白蛋白结合位点，从而具有一定的抗凝作用。非诺贝特还可通过减少纤溶酶原激活物抑制剂1的合成而促进纤溶作用［6］。尚未见的非诺贝特是否影响TF的促凝血活性的报道。本研究表明非诺贝特不仅抑制LPS诱导的单核细胞TF蛋白表达，而且以浓度依赖的方式抑制LPS诱导的单核细胞TF促凝血活性。

    蛋白水平研究的结果显示，非诺贝特抑制了LPS诱导下的单核细胞表面TF蛋白表达。非诺贝特抑制TF表达的作用机制可能是通过与PPARɑ结合，抑制核因子(NF)кB和活化蛋白（AP）1的活化，从而抑制NFкB和AP1 依赖的TF转录［3］。但流式细胞术分析的结果并未包括高尔基体等含TF的胞内细胞器和可能从细胞上发射出去的载TF微粒［7］，因此其结果应结合进一步的TFPCA试验进行分析。传统对TFPCA的检测多使用发色底物法，但该法试剂盒昂贵，不易推广。近年一种简便价廉的全血TiFaCT法，经 Marsik等[8]证实了该法具有较高灵敏度和较好的特异性，并确认了该法在检测LPS诱导的凝固模式中的效果。本研究在全血TiFaCT法基础上进行了改进：其一选择了单核细胞株THP1作为研究对象，排除了全血中其它成份的影响；其二选择了细胞冻融液作为实验标本。完整细胞与细胞冻融液的比较中，细胞冻融液促凝活性更强，结果更稳定，其原因可能是细胞冻融后暴露的磷脂酰丝氨酸为凝血反应提供了丰富的促凝表面［9］。由于细胞冻融液缺乏正常全血中所含的凝血因子，所以在反应体系中补充了一定量的正常新鲜混合血浆，后者使反应体系更稳定，其中唯一的变化因素来自细胞冻融液中的TF。在对改良TiFaCT法的特异性鉴定中，TFPI的使用明显延长了LPS刺激下缩短的凝血时间，证实改良TiFaCT法可以较好地反映TFPCA的变化，适用于对TF的研究。本资料通过改良TiFaCT法证实了非诺贝特抑制LPS诱导下单核细胞TFPCA的增强，这可能是PPARɑ激动剂减少AS血栓形成并发症的机制之一。

    非诺贝特可以明显抑制LPS诱导下的TFPCA增加，但在无LPS诱导时对TFPCA无明显影响，表明非诺贝特并不影响正常状态下的凝血活性，而主要在单核细胞活化后表现出其对凝血的抑制作用。在临床治疗中，每日200 mg的常规剂量可使非诺贝特的血药浓度维持在50 μmol/L左右。当临床使用过高浓度的非诺贝特时，病人有可能发生横纹肌溶解症等严重的并发症[10]。因此，本研究检测了不同浓度非诺贝特对LPS诱导的THP1细胞TFPCA的影响，证明了其抑制作用具有浓度依赖性，10 μmol/L的非诺贝特预处理对LPS刺激的TFPCA无明显影响，在非诺贝特达到50 μmol/L浓度时表现出对TFPCA明显的抑制作用，继续加大非诺贝特剂量时(100 μmol/L)其抑制作用有增加趋势但并无统计学意义。提示在使用非诺贝特常规降血脂的同时，可能取得抑制TF表达异常升高的临床收益，从而可能减少血栓形成并发症的发生率。综上所述，PPARɑ激动剂抑制LPS诱导的单核细胞TF蛋白表达，并以浓度依赖的方式抑制LPS诱导下的单核细胞TFPCA，这可能是PPARɑ激动剂减少AS血栓形成并发症的又一作用，提示其在血栓性疾病的防治中可能具有更重要的临床价值。

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