RNA干扰及其在蛋白酶激活受体研究中的应用

作者：周保成 综述，周红    作者单位：江苏大学基础医学与医学技术学院，镇江 212013     【关键词】  RNA干扰； 蛋白酶激活受体； 炎症； 肿瘤

    RNA干扰(RNA interference, RNAi) 也称为转录后基因沉默(post  transcrip tional gene silencing, PTGS)，是由双链RNA分子介导的阻断或降低体内与之同源基因表达的过程，是一项新兴的基因阻抑技术[1,2]。蛋白酶激活受体(proteaseactivated receptors, PARs)属于与G蛋白相耦联的受体家族，表达于多种细胞，与炎症及肿瘤细胞的增殖、侵袭转移、血管生成等密切相关[35]。近年来，RNAi技术在PARs研究中也得到应用并取得了一些进展。本文就RNAi及其在PARs研究中的应用现状综述于下。

    1  RNAi的基础研究

    1.1  RNAi现象的认识历程  RNAi现象广泛存在于生物界,是生物体内的一种进化保守机制, 具有天然保护作用。1990 年,Napoli等在对矮牵牛花研究中,将一个能产生色素的基因置于一个强启动子之后导入细胞，试图使花的颜色更加丰富，结果有的花瓣出现花斑，有的花变成了白色。当时将这种现象称为协同抑制( cosuppression)。接着Romano 和Maciano于1992年在脉孢霉( neurospora crassa) 中发现了类似的现象并命名为“quelling”现象。直到1998年华盛顿卡耐基研究院的Fire和马萨诸塞大学癌症中心的Mello 才共同首次证明了RNAi现象[6]。他们将双链RNA注入秀丽隐杆线虫(C. elegans) ,使线虫基因表达受抑制，而且，注射双链比单独注射正义链或反义链抑制效应更加明显。接着，Kennerdell等在研究果蝇时也发现了RNAi现象。2001年Elbashir在哺乳动物中发现存在RNAi现象，至此，RNAi现象被人们广泛认识。

    1.2  RNAi的作用机制  RNA干扰过程包括起始阶段和效应阶段。（1）起始阶段：由于RNA病毒感染、人为等原因，生物细胞内出现双链RNA(double strain RNA ,dsRNA)。Dicer 酶是RNase Ⅲ家族中的一员，它含有4个结构区域, 从N端到C端依次为: DEAD /H解螺旋区、PAZ区域、2个串联的RNase Ⅲ区域和双链RNA结合区[7]。它能以一种ATP 依赖的方式逐步切割进入细胞的dsRNA,使之成为19～21 bp 的small interference RNA (siRNA),其每个片段的3′端都有2个悬垂的核苷酸。（2）效应阶段：siRNA结合一个核酶复合物形成RNA诱导沉默复合物(RNAinduced silencing complex， RISC) ，它是一个无活性的前体，需要在ATP存在的条件下使siRNA的双链解开，成为有活性的RISC，进而以碱基配对的方式识别、结合和降解体内与之同源的mRNA，干扰基因表达。此外，siRNA亦可作为靶mRNA的引物,在RNA依赖性RNA 多聚酶(RNA  dependent RNA polymerase,RdRP) 的作用下以靶mRNA为模板合成dsRNA,然后在Dicer酶的作用下被降解形成新的siRNA。新的siRNA又进入上述过程,反复循环，由此产生了RNAi作用的放大效应。

    1.3  RNAi的作用特征  RNAi作用有7个重要特征：（1）作用部位选择性。RNAi是由siRNA介导的靶基因转录后基因沉默，这种作用只针对靶基因的外显子序列，而对其启动子序列和内含子序列没有效应。（2）高度特异性。RNAi作用只高度特异地降解与之同源的靶mRNA，而不影响其它基因的表达。siRNA中任一碱基的突变都可使RNAi作用减弱或丧失。（3）高效性。相对少量的dsRNA 就可以使外源基因失活、内源基因沉默，诱使机体表现出特定基因缺失的表型。（4）高度稳定性。si RNA与细胞内某种保护性蛋白结合,从而使其具有相对的稳定性, 在细胞内可稳定存在3～4 d,半衰期远长于反义寡聚核苷酸。（5）高穿透性。RNAi具有很强的穿透能力,能在不同的细胞间长距离传递和维持。（6）浓度、时间双重依赖性。只有合适浓度的si RNA才能产生最大干扰效应，且干扰效应通常出现在注射dsRNA 6 h后,可持续72 h以上。（7）可遗传性。RNAi的效应可以通过生殖系统传递到后代。

    1.4  RNAi的引发物及其异同  能够引起RNAi作用的物质有3类：siRNA、miRNA和tasiRNA。其中tasiRNA是反式作用干扰小RNA(transacting siRNA)，由Peragine 等[8]在研究南芥时首先发现。与目前人们所熟知的siRNA和miRNA不同，tasiRNA只存在于植物细胞中，它的成熟需要miRNA 的介导，而且不产生扩增效应。目前对siRNA和miRNA的研究较多，应用较为广泛，两者之间有许多相同点和不同点[9,10]。相同点是：长度大致相同，约22 nt左右；都是Dicer的产物；都需Argonaute 家族蛋白的存在；都是RISC的组成成分，与RISC的结合有优势结合和等式结合两种方式。不同点是：siRNA是在RNAi 过程中形成的中间体,而miRNA 则是细胞内RNA 的固有组分之一； siRNA 来源于病毒RNA或人为导入, miRNA 来源于内源转录本；siRNA是由长dsRNA转变而来的, miRNA 则是由具有发夹状结构的pre miRNA 转变而来的； siRNA主要以双链形式存在，miRNA主要以单链形式存在；siRNA与靶mRNA 完全互补配对结合, miRNA 与靶RNA并不完全互补, 存在错配现象；siRNA 主要在转录后水平发挥作用, 而miRNA 只在蛋白质转录水平上发挥作用。

    1.5  dsRNA的构建

    1.5.1  RNAi片段的设计  Reynolds等[11]报道，RNAi的效果与靶mRNA分子的特点无关，而与siRNA本身的特点有关，并总结提出了设计siRNA的八条标准，以提高成功率。这8条标准是：G/C含量要适中，大约为30%～50%；正义链3’端15～19位碱基以A/T（U）为宜，且至少含有3个A/T（U）；链内不能有重复或回文序列；正义链的3位首选A；正义链的19位首选A；正义链的10位首选U；正义链的19位不能为G，也不能为C；正义链的13位不能为G。当然还需对这8条标准进行量化，符合一定量化标准的siRNA才有可能成为有功能的siRNA。

    1.5.2  siRNA的合成  siRNA的合成方法大致可分为5种:体外化学合成法、体外转录法、体外酶消化法；体内siRNA表达载体合成法和体内siRNA表达框架法。其中以体外化学合成法最为经典，现可由专门公司提供服务，简便高效，但价格昂贵。而体内siRNA表达载体合成法操作简便，成本较低，便于进行较长时间的基因功能研究，目前应用较为普遍，其基本思路是：细胞内存在RNA聚合酶Ⅲ，它能识别U 6启动子,从而使置于启动子之后的基因转录成RNA。当模板连续出现3～5 个“T”碱基时,转录就会终止。

    1.5.3  siRNA导入细胞的方法  一般体外化学合成、体外转录、体外酶消化法合成的siRNA可通过电转移、微注射或者转染的方法导入靶细胞，而表达载体合成法和表达框架法则需先转染靶细胞然后表达siRNA。近年来又出现了由纳米颗粒介导的siRNA体内靶向导入方法[12]。

    2  RNAi在蛋白酶激活受体研究中的应用

    PARs是一种与G蛋白相耦联的受体超家族，有7个跨膜结构区域。该受体家族共有4个亚型：按其发现的先后分别命名为PAR1、PAR2、PAR3和PAR4[13]。研究表明，PAR1、PAR2与炎症、肿瘤的病理机制关系密切，但具体作用环节及机理还未阐明。近年RNAi技术的出现为PARs的研究带来新的切入口，必将进一步推动对PARs的深入探讨和研究。

    2.1  探讨PAR1及PAR2在炎症中的作用  PAR1是第一个被发现的蛋白酶激活受体，可被凝血酶和FⅩa活化，参与介导血小板聚集，内皮细胞屏障功能障碍，趋化以及炎症反应等，并和肿瘤细胞的增殖有关[14]。PAR2是该受体家簇中唯一不被凝血酶激活的受体，可被生理浓度的胰蛋白酶和纤溶酶裂解和激活。TFⅦaⅩa复合体能更有效地激活PAR2。活化的PAR2可以促进炎性介质的释放、肿瘤细胞的增殖，以及肿瘤的生长、侵袭和转移等。研究发现，PAR1及PAR2在各种炎症中的作用不一。Chiu等[15]在对类风湿性关节炎（RA）的研究中，运用针对PAR1、PAR2的siRNA分析凝血酶导致RA病人滑膜渗出液中IL6升高的信号途径，结果发现凝血酶通过PAR1途径导致滑膜渗出液中IL6升高，且呈浓度/时间依赖性，而与PAR2无关。而Trian等[16] 发现PAR2参与介导了哮喘病人的气道炎症。他们通过脂质体将针对PAR2的siRNA导入人支气管平滑肌细胞（HASMC），使其PAR2基因沉默，人支气管平滑肌细胞总PAR2、细胞膜表面PAR2以及PAR2的mRNA水平均显著下降，同时也抑制了纤溶酶等诱导的[Ca2+]升高，从而有效缓解了哮喘病人的气道炎症及临床症状。随着RNAi技术的应用，将更加广泛、深入揭示PARs在各种炎症病理中的作用。

    2.2  探讨PAR1与PAR2在肿瘤细胞增殖中的作用  恶性肿瘤的一个突出特点是肿瘤细胞具有无限增殖能力，而PAR1、PAR2在很多肿瘤细胞是高表达的[17]，它们是否参与了肿瘤细胞增殖过程引起了人们的重视。Xu等[18]运用针对各种PAR的shRNA转染前列腺癌PC3细胞，用RTPCR检测各种PAR基因表达情况，同时采用细胞计数、流式细胞仪分析及PC3细胞在软琼脂上形成集落能力来检测细胞增殖情况。结果发现，转染相应shRNA48小时后，PC3细胞表达PAR1受抑制最明显，且PC3细胞生长及在软琼上形成集落的能力下降。流式细胞检测也显示转染24 h后PC3细胞很大部分处于G2/M期。这一研究结果充分显示PAR1在前列腺癌细胞的持续增殖过程中起了重要作用，通过RNAi技术能够阻断PAR1的表达，能够诱导PC3细胞凋亡。另外Caruso等[19] 采用RNAi技术研究了PAR2与表皮生长因子受体EGFR对胃癌细胞增殖的作用，发现PAR2活化后继而激活EGFR，促进AGS胃癌细胞的增殖，由此提示了PAR2促进AGS胃癌细胞增殖的新机制。

    2.3  探讨PAR1及PAR2在肿瘤细胞侵袭和转移中的作用  肿瘤细胞的侵袭和转移是区分肿瘤良恶性的重要特征，也是引起肿瘤病人死亡的主要原因。虽然PAR1及PAR2与肿瘤细胞侵袭和转移的关系得到较多研究，但仍有许多问题不清楚。陈珊等[20]研究了PAR1在B16F10黑色素瘤细胞转移中的作用。他们采用针对PAR1的siRNA转染B16F10黑色素瘤细胞，体外迁移实验显示，转染后的B16F10细胞迁移能力与对照组相比明显减弱。与此相类似，在动物实验中，阻断PAR1后，肿瘤细胞经血管迁移能力减弱，在肺部形成转移瘤的数目也减少，从而证明了PAR1具有促进肿瘤细胞转移的作用，并可作为研制抗肿瘤转移药物的新靶点。近年，Morris等[21]在研究乳腺癌细胞株MDAMB231 及 BT549的过程中，采用siRNA干扰肿瘤细胞PAR2的表达，结果肿瘤细胞的侵袭能力明显减弱，且肿瘤细胞内由FⅦa和FⅩa介导的磷酸肌醇水解及ERK1/2活化明显地被抑制，表明PAR2在乳腺癌细胞株MDAMB231 及 BT549上作为FⅦa和FⅩa的受体，对细胞的侵袭转移起着重要作用。另外，前列腺癌细胞表面的PAR1介导了凝血酶信号，诱导肿瘤细胞分泌黏附分子，从而促进肿瘤细胞侵袭和转移也通过RNAi技术得到了验证[22,23]。

    2.4  其它  目前，有研究者采用RNAi技术研究PARs介导的细胞信号在成纤维细胞中组织因子内化和运输中的作用。该研究表明PAR2介导了FⅦa的刺激信号，引起成纤维细胞组织因子的内化以及高尔基体中组织因子的动员[24]。而Patwardhan等[25]则将RNAi技术应用于疼痛学的研究，证明了PAR2在ε阿片受体的活化和痛觉的产生中具有重要作用。

    3  小结与展望

    RNAi技术为PARs研究提供了一个方便、快捷、可行的方法，但仍有许多问题急待解决：如何提高转染效率；怎样选择合适的siRNA浓度，以达到最佳的干扰效果，同时不良反应最低；如何使RNAi在体内长期存在；怎样避免RNAi的非特异性等。尽管如此，RNAi技术较传统的基因敲除技术具有操作简便、快速、周期短，成本低等特点，在PARs研究中将得到广泛应用并具有广阔的前景。

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