急性早幼粒细胞白血病患者网织血小板的检测与分析

作者：孙明艳，姜晓萍，陈立君，李家增，马 军    作者单位：哈尔滨市第一医院，哈尔滨血液病肿瘤研究所， 哈尔滨 150010     【摘要】  目的 了解急性早幼粒细胞白血病(APL)患者外周血网织血小板（RP）水平的变化规律，为APL临床诊治过程中骨髓造血功能的恢复及掌握血小板输注时机与频率提供理论依据。方法 采用流式细胞术测定27例APL患者及20名健康人RP%，并计数得出其相应的网织血小板绝对值（RPC）。结果 初诊时（3.43±1.47）及治疗中（7.03±3.61）患者的RP%均较正常对照组（1.37±0.52）升高（P＜0.05），而RPC（0.11±0.04，0.27±0.11）较正常对照组（0.35±0.10）明显降低（P＜0.01）；经化疗缓解时，其RP（3.87±1.08）及RPC（0.56±0.20）均高于正常对照组（P＜0.05）。缓解期的RP%较初诊时无明显变化（P＞0.05），RPC较初诊时明显增高（P＜0.01）。结论 在APL病程中连续检测RP及RPC的变化，有助于判断骨髓造血情况，同时为血小板输注与否的选择提供依据。

    【关键词】  急性早幼粒细胞白血病; 网织血小板（RP）

    Peripheral Reticulated Platelet Levels in Patients with Acute Promyelocytic Leukemia and it’s Clinical Significance

    SUN Mingyan，JIANG Xiaoping，CHEN Lijun，LI Jiazeng，MA Jun

    (Harbin Instatute of Hematology & Oncology，Harbin First Hospital，Harbin，150010，China)

    Abstract： Objective   To investigate the changes of reticulated platelets (RP) levels in patients with acute promyelocytic leukemia( APL),and to provide some useful information about the recovery of hematogenesis for patients with APL during clinical treatment and whether platelets infusion is necessary. Methods   The venous whole blood of 27cases APL patient and 20 normal controls RP expression were detected by flow cytometry. RPC was calculated according to the formula  count. Results   RP in APL patients of incipient and treatment stage increased than that of control group (P<0.05),but RPC of them lowered remarkably than that of control group (P<0.01).  While complete remission（CR），RP and RPC were both higher than that of control group (both P<0.05). The RP of relieved stage was closed to incipient stage（P＞0.05）, but the RPC higher (P<0.01).Conclusion   Continuously monitoring the RP and RPC could  help  hematologist  to  judge  hematopoietic severity of APL status or chemotherapy induced bone marrow suppression cases and make decisions on whether patients need or not and what is the best time for platelet transfusion.

    Key words：  Acute promyelocytic leukemia;  Reticulated platelets

    急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)是一组特异性基因活化性恶性造血系统肿瘤，属特殊类型的白血病。APL容易发生相关凝血病，患者常因合并DIC而导致出血死亡。因此在APL诊治过程中对其凝血异常的纠正至关重要。网织血小板(reticulated platelets，RP)是新释放入血液的血小板，代表着骨髓新生血小板的能力。近年研究认为，其检测对判定白血病化疗后的骨髓恢复很有帮助。

    本研究选择了初诊的APL患者，并跟踪观察其在发病时、治疗中和缓解时的RP的变化。企以RP的变化提示诱导或强化治疗后APL患者骨髓造血的恢复，从而减少临床上接受化疗的APL患者预防性血小板输注的次数，为APL临床化疗的安全提供证据。

    1  资料与方法

    1.1  研究对象  27例初诊APL患者，男17例，女10例，年龄12～59岁，均为我所2006年3月～2007年2月的住院患者，初诊及完全缓解的诊断均符合《血液病诊断及疗效标准》[1]；另有2例患者治疗过程中突发脑出血死亡，被排除。另设20例健康的工作人员为对照组，男8人，女12人，年龄19～54岁。患者的分期：① 初诊时、未经治疗的APL患者。② 治疗中、初诊患者，经全反式维甲酸(ATRA)和三氧化二砷(As2O3)二者联用,治疗14±3 d，避开血小板输注当天，采取患者标本。③ 缓解期，患者的骨髓像及外周血像均符合完全缓解标准[1]

    1.2  网织血小板检测

    1.2.1  实验样本的留取  于清晨空腹、静息时采集正常对照组和初诊、治疗中、完全缓解的APL患者的EDTA抗凝血,作全血常规及网织血小板检测。

    1.2.2  预处理  EDTA抗凝血800 r/min离心5 min，取富含血小板血浆（PRP）5 μl与流式仪专用管中，同时加入CD61PE单克隆抗体 5 μl和ReticCount试剂（Thizal Orange）50 μl，混旋后室温避光15 min，加入PBS 1ml，30 min内上机检测。

    1.2.3  流式分析  以FSC–SSC的Log方式点图选取血小板区域，设为“门1”（R1）；TO  CD41PE点图选取双阳性区域，设为“门2”（R2）；从“GATE LIST”列表中定义G3=R1×R2，在SSCTO坐标中点图的左上方绘出一个倾斜的长方框，（框内即为网织血小板区）（R3），使得外部质控之RP%在1.0～1.5之间。调整好后，测定患者及正常对照的RP%。

    1.2.4  RPC的计算  RPC = RP% × 外周血小板计数（×109/L）

    1.3  统计学处理  应用t检验。

    2  结    果

    2.1  APL患者的RP及RP绝对计数（RPC）的变化与正常对照组的比较

    2.1.1  APL患者的RP（%）初诊时及缓解时分别为，均高于正常对照组（P＜0.05）；而治疗中的RP（%）显著高于正常对照组（P＜0.01）。见表1、图1。

    2.1.2  APL患者初诊与治疗中的RPC（× 109/L）均低于正常对照，（P＜0.05）；而缓解时RPC则显著高于正常对照（P＜0.01）。见表1。

    2.2  APL患者不同病期间RP及RPC的比较

    2.2.1  APL患者的RP（%）在治疗中最高，与初诊和缓解时相比有显著差异（P＜0.01 ）。见表1、图1。

    2.2.2  APL患者初诊时的RPC最低，治疗中有所升高，与初诊相比有显著差异（P＜0.05）；缓解时最高，与初诊和治疗中相比均有显著差异（P＜0.01）。见表1。表1  APL不同病期RP及RPC水平的改变 *与正常对照组相比，P＜0.05；**与正常对照组相比，P＜0.01

   3  讨    论

    网织血小板（RP）来源于骨髓巨核细胞，是新释放入血液循环的新生血小板。其体积较大、蛋白合成能力强，核酸水平较高，尤其是mRNA水平较普通血小板高，因此能如网织红细胞那样，判断血小板的生成状况。Richards等[2]报道在失血或血小板破坏增多的情况下，RP百分率明显增高。向晓娟等[3]报道了流式细胞术检测RP的方法，并对几种不同的血液系统疾病患者及正常健康人进行测定后认为，RP百分率与RP绝对计数(RPC)，能反映骨髓血小板生成率，可作为鉴别血小板生成障碍还是破坏过多引起血小板减少的指标之一，且RP百分率可作为外周血小板计数恢复状况的预测指标。

    有关流式细胞术检测RP的方法近年来国内外报道较多，且己成功地应用于临床。Kienast 等[4]较早报道采用全血法流式细胞术测定血小板功能及RP水平(百分率及绝对值)。他认为采用全血法流式细胞术检测血小板功能能最大程度地减小血小板离体后的自身活化，其黏附、聚集等功能更接近体内状态。 

    Stohlawetz 等[5]对AML患者接受化疗期间的血小板计数、网织血小板百分率及绝对值进行了双盲法前瞻性研究，认为在化疗期间对AML患者监测RP更有意义，它能提示诱导或强化治疗后骨髓造血的恢复，并能减少临床上接受化疗的AML患者预防性血小板输注的次数，并建议重新修定临床上AML患者预防性输注血小板的外周血小板计数的界值。

    鸟羽健[6]分析了17例血液肿瘤化疗过程中血小板的恢复情况，以RP的上升或下降判定其后7 d内血小板是否能够升高。Chaoui等[7]为47例强化疗后接受外周血造血干细胞移植（peripheral blood progenitor cell transplantation ,PBPCT）的患者连续检测其RP%，用以监测PLT恢复情况；认为PBPCT后,若Day+8 的RP% >7%，预示着患者血小板自主恢复将发生于未来4 d内，这可以帮助临床及时调整血小板输注的策略。

    我们采用的检测外周血RP的方法是鸟羽健2000年建立的“改良Matric法”[6]。本实验结果显示白血病患者在初发时，尽管其外周血小板计数可能下降，但其RP(%)较正常对照组升高，这提示我们APL患者虽然巨核细胞系受到APL细胞异常增生的抑制,但仍旧发挥着产生血小板的作用。李敏霞[8]等报告了急性白血病患者存在着免疫性血小板减少及外周循环破坏增加，这可能是血小板减少的另外一个原因。我们认为APL患者体内可能也存在这样的因素，因而同样刺激了骨髓巨核细胞，增强了其新生血小板的能力。APL患者治疗中的RP较初诊时又有所增高。我们认为，在化疗进行到第14天左右，随着白血病细胞凋亡或分化，虽然外周血小板数还未升高，RPC同样处于较低水平，但骨髓巨核细胞逐渐恢复产板能力，同时提示了骨髓造血正逐步恢复。经化疗后缓解期患者外周血小板计数虽然恢复或接近正常，但其RP（%）有所下降，却并未下降至正常。我们认为这可能与并未选取长期缓解的患者有关。我们观察的APL患者是从初诊经治疗达到完全缓解标准的，可能RP下降也是循序渐进的。我们也将对长期缓解的患者作RP的检测，以观察其长期缓解时的水平。

    关于对RP检测时，受到外周血小板计数(BPC)水平的影响问题，Ault等[9]认为当外周BPC<50 000/μl时，RP绝对水平正常或下降就不能作为判断血小板生成的可信指标。阴怀清[10]认为初发白血病患者外周血BPC在30 000～50 000/μl，其结果仍能反映RP的真实水平。我们检测APL患者中外周BPC最低为11 000/μl，结果仍能反映RP的真实情况。因而我们认为当外周血小板计数＜10 000/μl应考虑是否会对RP检测有所影响。

    我们建议，在急性白血病患者接受化疗的过程中，除BPC外，应连续监测RP及RPC的变化，不仅其有助于判断患者骨髓造血功能,同时有助于确定血小板是否输注。

    【参考文献】[1] 张之南，沈悌.血液病诊断及疗效标准[M].第三版.北京:科学出版社，2007.

[2] RICHARDS EM, BAGLIN TP. Quantitation of reticulated platelet: methodologyand clinical application[J]. Br. J Haematol, 1997, 91:445451.

[3] 向晓娟，邓承棋，牛 挺，等.流式细胞术检测网织血小板[J].中华血液学杂志，2000，21（9): 501502.

[4] KIENAST J , SCHMITZ G. Flow cytometric analysis of thiazole Orange up take by platelets: a diagnostic aid in the evaluation of thrombocytopenic disorders[J]. Blood, 1990，75: 116 120.

[5] STOHLAWETZ P, STIEGLER G, KNOBL P，et al. The rise of reticulated after intensive chemotherapy for AML reduces the need for platelet transfusions[J]. Ann Hematol, 1999, 78: 271273.

[6] 鸟羽 健，布施 一郎，小池 正，他. Matricの变法にょゐチアゾ—ル·ォレンジ法を用ぃた网织血小板测定の临床应用[J]. 临床血液，2000，41：11511157.

[7] CHAOUI D, CHAKROUN T, ROBERT F，et al. Reticulated platelets: a reliable measure to reduce prophylactic platelet transfusions after intensive chemotherapy[J].transfusion，2005，45：766772.

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[10] 阴怀清,乔振华,朱 镭，等.儿童急性白血病血小板膜糖蛋白表达及网织血小板水平的研究[J].山西医科大学学报，2006 ,37 (5):477480.