冠心病患者阿司匹林抵抗与识别活化血小板GPⅡb/Ⅲa复合物单克隆抗体(PAC1)的相关性研究

冠心病患者阿司匹林抵抗与识别活化血小板GPⅡb/Ⅲa复合物单克隆抗体(PAC1)的相关性研究作者：吴海锋， 杨镇平　 林钢毅    作者单位：1.增城市仙村医院 广东，增城511335　2. 惠州市中心人民医院 广东，惠州 516001 3. 汕头中心医院 广东，汕头 515031   【摘要】  目的 探讨冠心病患者阿司匹林抵抗现象(AR)与PAC1的相关性。方法 经冠脉造影确诊为冠心病患者80例，服用阿司匹林100 mg/d ≥7d，以二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)为诱导剂测定血小板聚集率，以ADP诱导的血小板聚集率≥70%定义为AR，<70%为阿司匹林敏感(aspirin sensitive，AS)。同时测定患者血小板PAC1的表达阳性率。结果 AR的发生率为20%，两组患者服药后血小板PAC1表达有显著性差异，AR组患者服药后PAC1水平显著高于AS组(P <0.05)。结论 冠心病患者AR的发生率为20%，PAC1可作为检测AR的有效指标。   【关键词】  冠心病; 阿司匹林抵抗; 识别活化血小板GPⅡb/Ⅲa复合物单克隆抗体   Study on Correlation Between Aspirin Resistance and PCA1 of Platelet in Patients with Coronary Heart Disease　　WU Haifeng1 ，YANG Zhenping2， LIN Gangyi3　(1. Department of Internal Medicine, Zengchen Xiancun Hospital, Zengchen, 511335, China; 2. Huizhou Municipal Central Hospital, Huizhou, 516001, China; 3. Shantou Central Hospital, Shantou, 515031, China)　　Abstract： Objective To investigate the correlation between aspirin resistance (AR) and PAC1 expression of platelet in patients with coronary heart disease(CHD). Methods 80 CHD patients diagnosed by coronary artery angiogram took aspirin 100 mg/ d for ≥7 d, and then their blood samples were collected for determination of optical platelet aggregation index using adenosine diphosphate(ADP). AR was defined as a state in which aggregation of ≥70% with ADP was found. We detected platelet aggregation (PAG) induced with adenosine diphosphate (ADP) and expression of PCA 1 in platelet . Results 20% of patients showed AR. The expression of PCA1 was significantly higher in AR patients than in AS (P < 0.05) . Conclusion The AR accounts for 20 % of all. PAC1 could be considered as the sensitive index of platelet activation and be used in the evaluation of antiplatelet therapy.　　Key words： Coronary heart disease ; Aspirin resistance ; PCA1　　阿司匹林广泛用于动脉血栓栓塞性疾病的防治。但阿司匹林的抗血小板聚集作用并非对所有患者有效,部分服用治疗剂量甚至大剂量阿司匹林的患者仍然发生了血栓栓塞性事件, 此现象被称为临床阿司匹林抵抗( aspirin resistance ,AR)。PAC1为一识别活化血小板GPⅡb/Ⅲa复合物单克隆抗体，在血小板活化后，GPⅡb/Ⅲa受体的活性表达是引起血小板聚集的最后通路，检测血小板表面PAC1的表达量可以更精确地、更早阶段检测到血小板的活化。本实验主要探讨阿司匹林抵抗与PAC1的关系,为进一步识别AR提供参考依据。1 资料与方法　　1.1 对象 2007年2月至2008年5月本院有胸闷和/或胸痛症状,同时经冠状动脉(冠脉) 造影确诊为冠心病门诊、住院患者80 例。入选标准:已服用阿司匹林100 mg/ d ,服用时间≥1 周。排除标准: (1) 2 周内服用过氯吡格雷、噻氯匹定、非甾体抗炎药、华法林或使用肝素者; (2) 急性冠脉综合征患者，心功能Ⅳ级特别是危重病人;(3) 2 个月内有脑血管意外史者; (4) 肝、肾、呼吸功能不全者; (5) 近期有外伤、手术及出血史者;(6) 各种血液病及出血性疾病者; (7) 消化性溃疡和其他消化道疾病者; (8) 急、慢性感染者。　　1.2 方法　　1.2.1 血小板聚集率的测定 患者每日早饭后30 min服用肠溶阿司匹林100 mg，连服7 d。7 d时空腹服药后抽取肘静脉血，标本保存在3.8 %枸橼酸钠抗凝的真空管内，2 h 内上机,用10 μmol/ L 的二磷酸腺苷作为激动剂。制备富血小板和乏血小板血浆,40 min内测量。结果用聚集百分率表示。　　1.2.2 PAC1的测定 使用EPICS流式细胞仪(美国贝克漫库尔特公司)测定PAC1的阳性表达率。对象抽取静脉血，不扎止血带，弃去前2 ml可能混有组织液的血液。吸入枸橼酸钠缓冲液抗凝真空管(CTAD管)，加入PAC1 FITC，室温避光孵育20 min，上机检测。　　1.3 评价标准 根据文献的方法[1]，用ADP诱导的血小板聚集率≥70%定义为AR，<70%定义为AS。　　1.4 统计学处理 应用SPSS for Windows 13.0 软件。计量资料以.x±s 表示。组间比较采用方差分析或t 检验。计数治疗采用百分数表示,组间比较采用χ2 检验, P < 0.05 为有显著性差异。2 结 果　　2.1 血小板聚集率定义的AR 发生率 所有患者中，AS 者45例(80%)，AR者15 例(20%) 。　　2.2 AR 与AS 组PCA1水平的比较 用药前两组PCA1的阳性率无显著差异，服用阿司匹林7 d 后，AR 组患者的PCA1表达的阳性率高于AS 组，并且两组之间有显著性差异( P < 0.05)。见表1。表1 80例冠心病患者治疗前后PCA1的表达情况注：*与AS组相比，有显著性差异( P < 0.05)3 讨 论　　目前对AR的发生率报道差异较大,一般为8 %～40 %[2] 。本研究结果介于上述报道范围之间。目前认为AR的机制可能为：① 存在由非COX介导的血小板激活途径。 ② 与环氧化酶2(COX 2)表达增加有关。 ③ 与COX 1存在基因突变有关。④ 与GPⅡb/Ⅲa 受体复合物基因多态现象有关。Giles等[3]报道，在冠心病患者中，血小板PCA1的表达均明显高于对照组。体外研究发现，在活化的血小板表面存在PAC1等多种糖蛋白的表达，且体外阿司匹林可以抑制PCA1的表达[4]。PAC1是血小板质膜表面的糖蛋白的表位。它仅在血小板活化时因构象变化而显露出来。是细胞黏附受体整合家族中的一员，含有纤维蛋白原、纤维连接蛋白等黏附蛋白的特异结合位点[5]。PAC1以一定的三级空间结构存在于血小板膜表面。当血小板活化时构型发生变化，暴露出纤维蛋白原等的结合位点，通过识别配体中氨基酸序列来与配体结合，纤维蛋白原可以同时和至少两个配体结合，血小板通过各自表面的与纤维蛋白原结合，形成“桥链”，导致相邻血小板间聚集、活化[6]。循环活化血小板中的PAC  1 是血小板活化早期的标志物,即GPⅡb/ Ⅲa 复合物。抗体与活化后血小板膜表面的GPⅡb/ Ⅲa 复合物纤维蛋白原结合位点相结合。在血栓的发生、发展过程中,由于血管内皮损伤后胶原暴露,可促使血小板黏附并活化,PAC 1 存在于血小板膜表面,在血小板活化时,表达上调,其上有纤维蛋白原的结合位点。GPⅡb/Ⅲa与纤维蛋白原结合是多种因素引起血小板聚集的共同途径[7 ] 。本研究结果提示PCA1可作为检测阿司匹林抵抗的另一种方法。但本实验选择病例数有限，尚有待于更大规模的临床观察。【参考文献】　　[1] GUM PA, KOTTKEMARCHANT K, POGGIO ED, et al. Profile and prevalence of aspirin resistance in patients with cardiovascular disease[J]. Am J Cardiol，2001,88: 230235.　　[2] 罗玉兰,周从义. 肌袖性心房扑动[J]. 实用心电图杂志, 2004, 13: 7879.　　[3] GILES H, SMITH RE, MARTIN JF. Platelet glycoprotein Ⅱb/Ⅲa and size are increased in acute myocardial infarction[J].Eur J Clin Invest, 1994,24:6972.　　[4] MCKENZIE ME, MALININ AI, BELL CR, et al. Aspirin inhibits surface glycoprotein Ⅱb/Ⅲa, Pselection, CD63, and CD107a receptor expression on human platelets[J]. Blood Coagul Fibrinolysis, 2003,14:249253.　　[5] ZIMMERMANN N, WENK A, KIM U, et al. Functional and biochemical evaluation of platelet aspirin resistance after coronary artery bypass surgery[J]. Circulation, 2003,108:542547.　　[6] KARIM S,HABIB A,LEVY-TOLEDANO S, et al. Cyclooxygenase1 and 2 of endothelial cells utilize exogenous or endogenous arachidonic acid for transcellular production of thromboxane[J].J Biol Chem,1996,271:1204212048.　　[7] MICHELSON AD, BARNARD MR, HECHTMAN HB, et al. In vivo tracting of platelets: circulating degranulated platelets rapidly lose surface Pselectin but continue to circulate and function[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93:1187711882.