低剂量照射治疗免疫介导性再生障碍性贫血的实验研究

低剂量照射治疗免疫介导性再生障碍性贫血的实验研究作者：刘洪涛， 　赵钧铭，　褚建新    作者单位：中国医学科学院 血液学研究所，天津　300020； 1唐山工人医院血液科，唐山 063000    【摘要】  　　免疫介导性再生障碍性贫血（immunomediated aplastic anemia, IMAA）时淋巴细胞处于激活状态，被抑制的造血干细胞处于静止状态，据此本研究探讨一项新的治疗IMAA的策略，即利用激活的淋巴细胞和静止的造血干细胞对放射敏感性的差异，给IMAA小鼠低剂量全身照射，此低剂量照射既可杀灭免疫活性淋巴细胞，解除它对造血干细胞的抑制，又不损害造血干细胞，从而使造血得以恢复。实验应用免疫介导性再生障碍性贫血小鼠模型完成，于造模后第4天全身照射150 cGy，以不治疗照射组和单纯照射组小鼠为对照，观察各组小鼠生存时间和生存率、血象和骨髓有核细胞数、骨髓和淋巴组织的病理形态改变。结果表明：　 ①IMAA组小鼠活存率为12.5%，平均存活时间为27.4±13.4天，照射治疗组活存率为100%，平均存活时间60天以上，单纯照射组无死亡；②外周血白细胞数： IMAA组呈进行性下降，直至死亡，照射治疗组第10天与免疫再障组相似，以后开始缓慢回升，基本上达到治疗前水平；　③红细胞比容：未治疗IMAA组于14天后呈进行性降低, 至第35天比实验前减低2/3，照射治疗组与单纯照射组一样，第14天有轻度减低随后升高，至35天接近正常；　④骨髓有核细胞数： IMAA组呈进行性减低，无恢复趋势，照射治疗组于一过性减低后迅速增加，第28天达到正常水平；　⑤骨髓和淋巴组织病理形态观察： IMAA组小鼠呈典型再生障碍性贫血病理改变，骨髓造血衰竭，脾脏明显萎缩，而照射治疗组于第28天骨髓和脾淋巴脏组织基本上恢复正常。　结论：低剂量全身照射对IMAA小鼠有明显的治疗作用，骨髓和淋巴组织完全恢复；其疗效机制可能与低剂量照射杀灭免疫活性淋巴细胞解除了对造血干细胞的抑制有关。本研究结果不仅为免疫介导性再生障碍性贫血提出了一种新的治疗对策，而且为免疫介导性再生障碍性贫血机制的研究提供了新线索，在文献中尚未见有类似报道。    【关键词】  低剂量照射　免疫介导性再生障碍性贫血 小鼠　免疫活性细胞　　Experimental Study of Low Dose Irradiation for Treatment of ImmunoMediated Aplastic Anemia  in Mice  LIU Hong Tao1 ,  ZHAO Jun Ming,   CHU Jian Xin  Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin 200030, China; 1Department of Hematology, Tangshan Worker Hospital,  Tangshan 063000, China    Abstract    As the lymphocytes of immunomediated aplastic anemia (IMAA) are  in active state, and the hematopoietic stem cells are  in silence, this study was aimed to design a new strategy to treat IMAA. To utilize the  difference of radiosensitivity between  active lymphocytes and silent hematopoietic stem cells, the animals suffered from IMAA were treated with a single low dose of irradiation,  killing the active lymphocytes to release its suppression to hematopoietic stem cells  without injuring the hematopoietic stem cells. Therefore, the hematopoiesis can be restored. Experiments were completed in IMAA mouse model. At day 4  after making IMAA, the  model mice  were giren total body irradiation of 150 cGy, the nontreated model mice and normal mice irradiated  with 150 cGy were used as control. The survive time and survive rate of mice, blood picture, the account of nucleated cell of bone marrow, and pathological changes of bone marrow and lymphoid tissues of each group mice were observed. The results were as follows: (1) Survive rate of IMAA mice in nontreated group was 12.5%, the average survive time was 27.4±13.4 days. 100% of IMAA mice in irradiationtreated group survived over 60 days. The mice of irradiation control group all survived. (2) The account of WBC of IMAA mice in nontreated group dramatically decreased until to die, and in the irradiationtreated group it was gradually increased since  the 10th day after treatment and close to normal level at the 28th day. (3) The RBC hematocrit of IMAA mice in nontreated group progressively  decreased at  day 14, and IMAA mice of irradiationtreated group gradually recovered closely to normal level after slightly fall at  day  14, similar  to the mice of irradiation control group. (4) The account of nucleated cells of bone marrow in nontreated IMAA mice dramatically decreased, and in the IMAA mice of the irradiationtreated group it was rapidly increased following transient fall, and restored to normal. (5) Pathological obser vations showed that the bone  marrow and spleen of nontreated IMAA mice demonstrated typical aplastic anemia pattern, including bone marrow  failure,   marked  splenatrophy, but  the bone marrow and  lymphoid tissues in the IMAA mice of irradiationtreated group were  recovered to normal at  day 28  after treatment.  It  is concluded that the  low dose of  irradiation displayed a significant therapeutic effect to IMAA mice, their hematopoisis could  be  completely restored to normal. The mechanism of therapeutic effect may contribute to low dose of irradiation killing the immunocompetent lymphocytes,  therefore,  suppressing  hematopoiesis. The experiment results not only set up  a new strategy for IMAA treatment, but also provided a clue to study the mechanism of IMAA.    Key wards    low dose irradiation; immunomediated aplastic anemia; immunocompetent   lymphocytes    J Exp Hematol 2007; 15(3):510-514    中国实验血液学杂志  J Exp Hematol 2007; 15(3)低剂量照射治疗免疫性再生障碍性贫血的实验研究    近年来的研究证明，免疫介导性再生障碍性贫血（immunomediated aplastic anemia, IMAA)的骨髓造血干细胞的质量无明显异常，主要是T淋巴细胞数量与功能的异常，以及异常T细胞克隆的产生。这些异常改变在IMAA发生发展中起重要作用［1-5］。采用免疫抑制治疗对于这种类型的AA具有明显的治疗效果［ 6-8］，但免疫抑制剂的副作用较大，例如应用疗效较好的抗胸腺球蛋白，患者也常因高热不退而难以坚持治疗。    本研究根据IMAA发生的机制，即淋巴细胞（主要为T淋巴细胞）处于激活状态，直接或产生淋巴因子间接地对造血干细胞产生负调控作用，从而导致骨髓各系造血细胞减少。也就是说，在IMAA发生过程中，免疫淋巴细胞处于激活状态，造血干细胞处于抑制或静止状态。众所周知，淋巴细胞，特别是激活状态的淋巴细胞对辐射比较敏感，而处于抑制或静止状态的造血干细胞对辐射不甚敏感。本研究利用淋巴细胞与造血干细胞对放射敏感性的差异提出了一项治疗IMAA的新设想，即选择适当的放射剂量对免疫再生障碍性贫血小鼠进行全身照射，一方面杀灭或抑制激活的淋巴细胞，解除其对造血干细胞的负性调控作用，另一方面又不至损伤骨髓造血干细胞，使造血干细胞能增殖和分化，恢复正常造血功能，达到治疗免疫再障的目的。    为了验证这一设想，我们以IMAA小鼠为模型，探讨了不同放射剂量和不同治疗时间的效应，最终确定了造模后第4天全身照射150 cGy作为治疗方案，并获得了理想的实验结果。经放射治疗的IMAA小鼠的存活率达到100％，生存时间在60天以上。本研究为探讨IMAA治疗提供一种新的治疗途径，在国内外文献中尚未见有类似报道。    材料和方法    实验动物    受体小鼠：BALB/c小鼠（H2d，MLSb），8-12周龄，20-25 g，雌性。    供体小鼠：DBA/2小鼠（H2d，MLSa），6-14周龄，18-20 g，雌雄兼用；作为淋巴细胞供者。上述两种小鼠均购自北京中国医科院实验动物研究所。    试剂    Hanks液，白细胞分离液，小鼠CD3、CD4、CD8单克隆抗体，NH4Cl Tris液，台盼蓝等均由中国医学科学院血液学研究所实验病理室和免疫室提供。    照射条件    采用铯源 γ射线照射 （Gammacell Canada），剂量率为89.2 cGy/min，对实验小鼠进行全身照射。    胸腺－淋巴结细胞悬液制备    将DBA/2小鼠断颈处死后，在无菌条件下取出胸腺和肠系膜淋巴结，分别剪碎、冲洗、4号针头抽吸，使之成为单细胞悬液。经台盼蓝拒染试验，活性细胞为95%以上；将胸腺与淋巴结细胞按1∶2混合，配制成浓度为5×106/ml的淋巴细胞混合液，4℃保存待用。    小鼠IMAA模型的建立    依照姚军等［9］并参考周永明等［10］的方法稍加改进，受体BALB/c小鼠全身照射剂量由600 cGy改为500 cGy，于照射后4小时内经尾静脉输入取自DBA/2小鼠胸腺、淋巴结的混合细胞，细胞数为1×106/只，AA小鼠发病率为100%，生存时间比姚军等的实验结果明显延长，有利于观察本实验治疗方案的疗效。    实验方案和分组    单纯照射组  18只小鼠，9只观察生存期，9只动态活杀检测。BALB/c小鼠全身照射500 cGy，不作任何处理。    IMAA模型组  17只小鼠，8只观察生存期，9只动态活杀检测。BALB/c小鼠经500 cGy全身照射后4小时内，经尾静脉注射DBA/2小鼠的胸腺淋巴结混合细胞悬液（1×106/只）。    照射治疗组  17只小鼠，8只观察生存期，9只动态活杀检测。小鼠AA模型复制与IMAA模型组相同，于制模后第4天全身照射150 cGy。为探讨照射最佳时间和照射剂量，我们曾观察了制模后第5天照射150 cGy或200 cGy和第4天照射150 cGy或200 cGy后小鼠状态。这些小鼠一般状态较差，白细胞数低，死亡率高（结果未列入），以第4天给予150 cGy照射疗效最佳，故本实验选择该治疗方案进行。    观察指标    体重  各组小鼠在实验前及实验后第4、10、14、20、28、35天称量体重。    生存期和生存率  记录各组小鼠死亡时间，计算出平均生存时间，并以60天为限，绘制各组小鼠累积生存率图。    血象检查  各组小鼠在实验前和实验后第4、10、14、20、28、35天，采取小鼠尾静脉血，按照常规方法计数白细胞数、测定红细胞比容。    骨髓有核细胞（BMNC）计数  实验第10、15、28天各组分别活杀3只小鼠，取每只小鼠一侧股骨，用Hanks液冲出股骨骨髓，按常规方法计数1根股骨中的骨髓有核细胞数。    病理形态观察  实验第10、15、28天在各组分别取小鼠另一侧股骨、脾脏、肝脏、胸腺、肠系膜淋巴结，用10%甲醛固定，石蜡切片，HE染色，行显微镜镜检。    结    果    一般情况    单纯照射组  小鼠仅有短期食量减少，照射后2周恢复正常。    IMAA模型组  小鼠于10天后食量明显减少，体重进行性下降，耳及脚趾苍白，毛发稀疏无光泽，最后伏卧不动呈濒死状；在35天前后出现死亡高峰，解剖示胸腺、淋巴结、脾脏极度萎缩，与文献描述相似。    照射治疗组  小鼠于10天前与IMAA模型组表现相似，但2周后明显好转，食量增加，体重回升，毛色也逐渐恢复，到第4周时外观已大致正常。    各组小鼠存活情况（图1）    单纯照射组  9只小鼠，除1只于第26天意外死亡外，均健康活存。    IMAA模型组  8只小鼠中死亡7只，生存率为12.5%，平均存活时间为27.4±13.4天，死亡高峰时间在35天左右。    照射治疗组  8只小鼠观察60天无一只死亡，生存率为100%。    Figure 1.  Cumulatine curve of mouse survival in various groups.    外周血WBC计数（表1）    单纯照射组  于照射后WBC数有所下降，第10天降至最低点，以后逐步恢复，第21天已基本在正常范围。    IMAA模型组  第4、第10天WBC数明显减低，随后呈进行性下降，至第35天仅为实验前1/9。    照射治疗组  开始的WBC数降低趋势与IMAA模型组相同，第14天开始回升，第35天已接近正常，稍低于单纯照射组。    红细胞比容（图 2）    IMAA模型组  第10天开始减少，随后呈进行性下降，至第35天降低了2/3。    照射治疗组与单纯照射组  改变相同，第14天有所降低，随后逐渐升高，至第35天时接近正常。    Figure 2.  Dynamic change of  hematocrit  in various groups.    骨髓有核细胞数（BMNC）（表2）    单纯照射组  第10天时明显减低，第15天时开始增加，至第28天基本恢复正常。    IMAA模型组  第28天仍保持最低水平，无上升趋势。    照射治疗组  第15天开始增加，至28天达到8.4±1.64×106，远高于IMAA组，略低于单纯照射组。    病理形态变化（图3，图4）    单纯照射组  骨髓早期增生减低，第10天出现灶性造血，第28天增生明显活跃，仅见少数脂肪细胞；脾脏早期萎缩，第28天脾脏形态基本恢复正常。    IMAA模型组  骨髓早期增生减低，第10天无增生迹象，第28天骨髓增生极度低下，髓腔充血、淤血，几乎为脂肪细胞代替，呈典型再障改变；脾滤泡萎缩，无明显髓外造血，淋巴结明显萎缩，胸腺轻度萎缩。    照射治疗组  早期骨髓增生情况与再生障碍性贫血组（IMAA）相似，第10天出现灶性增生，第28天骨髓增生活跃，仅见个别脂肪细胞；脾脏、淋巴结和胸腺结构基本上恢复正常；此外，脾及肝脏出现明显髓外造血灶。   讨    论    本研究结果表明，免疫介导再生障碍性贫血小鼠经一次低剂量全身照射（150 cGy）后活存率可达100％，生存时间达60天以上；小鼠的外周血WBC数、红细胞比容以及骨髓有核细胞数于照射治疗后第28天和第35天基本上恢复到治疗前水平；骨髓和淋巴组织形态也恢复正常。未经治疗的AA小鼠，仅有1只存活，活存率为12.5%，血像、骨髓有核细胞计数以及骨髓、淋巴组织病理学检查均呈现典型的AA表现。由此可见，低剂量全身照射对IMAA小鼠具有明显的治疗作用，可以认为已达到治愈的效果。采用同一剂量（150 cGy）于造模后第5天照射，或采用200 cGy于造模后第4天照射，疗效明显减低（资料未列出）。这些结果提示照射时间和照射剂量与疗效有明显关系，这可能与低剂量照射杀灭免疫活性淋巴细胞以及对造血干细胞损伤的程度有关；杀灭淋巴细胞不足或损伤造血干细胞过重都不利IMAA小鼠造血的恢复。    从小鼠IMAA模型发生的过程来看，是先给小鼠亚致死剂量全身照射造成骨髓一过性增生低下，当造血干细胞增殖时输入同种异型T淋巴细胞抑制其增殖和分化，致骨髓造血衰竭和全血细胞减少，呈典型的AA表现，死亡率甚高［9,10］。本研究中AA模型组也重现了这一结果。因此，该模型小鼠的骨髓造血衰竭和淋巴组织萎缩显然与同种异型T淋巴细胞输注有直接关系。本研究于淋巴细胞输注后第4天给予一次低剂量全身照射，结果小鼠全部恢复了造血，与单纯照射组自发恢复无明显差异。因而有理由推论，该照射剂量一方面杀灭了输入的同种异型淋巴细胞，解除了它对造血干细胞的抑制，同时又未明显损伤造血干细胞，影响其增殖和分化，从而使正常造血得以较快恢复。这一研究结果支持了我们的研究设想： IMAA小鼠体内激活的淋巴细胞和被抑制的造血细胞对放射敏感性存在差异，适当剂量全身照射既可抑制淋巴细胞增殖，解除其对造血干细胞的负性调控制作用，又不至于过度损伤骨髓造血干细胞，使造血恢复正常，起到治疗作用。    最近有研究证实，低剂量照射能够促进或增强动物体内的某些细胞因子如CSF、IL等的分泌水平［11］。粒细胞集落刺激因子（GCSF）能够促使G0期的造血干细胞进入细胞增殖周期，同时诱导骨髓池中各系祖细胞的释放［12］。本研究采用的低剂量照射对骨髓基质细胞能否促进骨髓造血的恢复，有待进一步研究证实。    目前，在临床上对IMAA一般采用免疫抑制剂治疗，如环孢菌素A、抗胸腺球蛋白、甲基强地松龙、丙种球蛋白等，单独或联合应用，疗程较长，副作用较大，有的抑制剂价格昂贵。患者获得完全和部分缓解率为50％左右，少数仍要复发［8］。免疫抑制剂治疗的作用原理，一般认为与抑制淋巴细胞、特别是T淋巴细胞活性有关，但关于免疫淋巴细胞抑制的程度和造血干细胞恢复造血的过程，尚未精确阐明［6］。本研究提出的治疗设想和初步的实验结果，不仅为IMAA治疗提供了一项新的治疗对策，而且对探讨IMAA发生机制提供新的线索。【参考文献】1Melenhorst JJ, vanKrieken JH, Dreef E, et al. 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