自体外周血纯化CD34+细胞移植对系统性红斑狼疮患者外周血CD4+CD25+T细胞表达的影响

作者：孙乐栋    作者单位：南方医科大学南方医院：皮肤科；血液科，广东广州 510515

【关键词】  造血干细胞 移植 CD4+CD25+T细胞 系统性红斑狼疮

　　Alteration of peripheral blood CD4+CD25+T cells in patients　with systemic lupus erythematosus after autologous　peripheral blood purified stem cells transplantation

　　Sun Ledong, Sun Jing, Zeng Kang, Meng Fanyi, Wang Qian,Liu Qifa, Peng Xuebiao, Xu Dan, Huang Liang, Zhao Jie, Zhou Zaigao

　　(Department of Dermatology; Department of Hematology, Nanfang Hospital,Southern Medical University, Guangzhou 510515, China)

　　ABSTRACT: Objective  To study changes of the peripheral blood CD4+CD25+T cells in patients with systemic lupus erythematosus after autologous peripheral blood purified stem cells transplantation. Methods  Totally 15 patients with systemic lupus erythematosus who had received autologous peripheral blood purified stem cells transplantation were recruited in this study. Flow cytometry was used to measure CD4+CD25+T cells counting before transplantation and at 3, 6, 12, 24 months after transplantation. Results  Before transplantation, the percentage of CD4+CD25+T cells was decreased. At 3, 6, 12, 24 months after transplantation, the CD4+CD25+T cells counting increased markedly compared with that before transplantation (P<0.05). There was no significant difference in percentage of CD4+CD25+T cells in pairwise comparisons of 6, 12, 24 months after transplantation. CD4+CD25+T cells of relapsed SLE were markedly lower than those of unrelapsed SLE. Conclusion  Autologous peripheral blood purified stem cells transplantation can effectively increase the level of CD4+CD25+T cells in patients with systemic lupus erythematosus.

　　KEY WORDS: stem cell; transplantation; CD4+CD25+T cell; systemic lupus erythematosus

　　近年来，自体外周血造血干细胞移植治疗系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)取得了满意疗效，其确切机制尚不完全清楚。但可以肯定的是原有的自身免疫性的细胞克隆受到彻底摧毁，重建正常免疫细胞体系是造血干细胞移植成功治疗自身免疫性疾病的关键。自身免疫和自身耐受之间是一个动态平衡过程。利用免疫抑制剂削弱自身免疫的力量，通过造血干细胞移植扶持自身耐受的力量，最终使机体恢复正常的免疫平衡系统，从理论上有可能达到治愈自身免疫性疾病的目的。    　　CD4+CD25+T细胞是调节性T细胞的亚群之一，主要来源于胸腺，其功能主要是与抑制自身反应性T细胞的免疫反应、抑制传统T细胞的活化及促进一些抑制性细胞因子的分泌等有关，在维持机体内环境稳定、肿瘤免疫监测、诱导移植耐受和自身免疫性疾病的发生中发挥重要作用[13]。我们以前的研究发现，SLE患者外周血CD4+CD25+T细胞表达水平与SLE的发病有关，并与病情活动程度有明显的相关性。因此，探讨自体外周血造血干细胞移植治疗对SLE外周血CD4+CD25+T细胞表达水平的影响，对了解自体外周血造血干细胞移植治疗SLE的发病机制具有一定的意义。

　　1  资料与方法

　　1.1  研究对象  选取2002年至2005年于我院就医行自体外周血纯化CD34+细胞移植的SLE患者15例，诊断均符合1982年美国风湿病学会制定的SLE诊断标准。其中男4例，女11例，年龄11-37岁。同时随机选取我院15名健康体检者作为对照组。其中男3名，女12名，年龄12-40岁。两组年龄、性别等具有可比性。全部患者和对照组均无糖尿病、哮喘、荨麻疹、湿疹、炎症性肠病和其他风湿病。研究遵循程序符合单位负责人体试验委员会所制定的伦理学标准，并得到该委员会的批准，所有受试者均签署知情同意书。

1.2  主要试剂及仪器  异硫氰荧光素(FITC)标记的鼠抗人CD4单克隆抗体(IgG2b)、藻红蛋白(PE)标记的鼠抗人CD25单克隆抗体(IgG2a)、同型对照Mouse IgG2b/FITC、同型对照Mouse IgG2a/PE均购自深圳晶美有限公司。FACSCalibur 型流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)。

　　1.3  外周血的采集  分别于移植前、移植后3、6、12、24个月取患者肘前静脉。使用一次性采血针抽血，用5mL注射器抽2mL静脉血丢弃，将注射器从采血针上取下后，将采血针插入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，取1mL静脉血沿试管壁缓慢注入抗凝管，6h内送检。同法采健康对照组外周血。

　　1.4  流式细胞术检测CD4+CD25+T细胞的表达情况  标本分成两个流式管，分别作检测管和同型对照管。取EDTA抗凝的SLE患者外周血100μL，分别放入各流式管，检测管加入FITC标记的鼠抗人CD4单克隆抗体(IgG2b)及PE标记的鼠抗人CD25单克隆抗体(IgG2a)，同型对照管加入Mouse IgG2b/FITC及Mouse IgG2a/PE各10μL，轻轻混匀，室温避光20min后，加入红细胞裂解液2mL，振荡混匀后避光至10min，1000r/min离心5min，弃上清；加入磷酸盐缓冲液(PBS)悬浮细胞，以1000r/min离心5min，弃上清；再用PBS 1次，离心弃上清，加入0.3mL PBS悬浮细胞，室温避光10min后上机。使用光源为488nm的氩激光。上机前先用标准微球进行光路和流路的教正，使变异系数在2%以下。用同型对照确定荧光阴性范围，根据细胞的前向角散射光(FSC)和侧向角散射光(SSC)特性初步圈取淋巴细胞群门，每份标本中测定淋巴细胞群门中10000个淋巴细胞中CD4+CD25+T细胞的百分率。

　　1.5  统计学处理  组间CD4+CD25+T细胞表达水平的比较应用SPSS10.0统计软件进行重复测量数据的方差分析。移植前SLE患者组与对照组外周血CD4+CD25+T细胞的表达水平的比较进行配对t检验。复发与未复发组间采取单向方差分析。结果中所列数据以±s表示。以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  移植前SLE患者外周血CD4+CD25+T细胞的表达水平  移植前SLE患者外周血CD4+CD25+T细胞的表达水平为(7.61±1.86)%，明显低于对照组(11.21±2.38)%，差异有统计学意义(t=8.025，P<0.01)。

　　2.2  移植前后不同时期SLE患者外周血CD4+CD25+T细胞的表达水平  CD4+CD25+T细胞在移植前后不同时间段均有不同程度的表达(图1)。移植前SLE患者外周血CD4+CD25+T细胞表达水平较低，移植后3个月开始增高，移植6、12、24月后恢复到较高水平。移植前后不同时间内CD4+CD25+T细胞表达水平的差异有统计学意义(F=19.502，P<0.01，表1)。

　　表1  移植前后不同时期SLE患者外周血CD4+CD25+T细胞的表达水平（略）

　　Table 1  Expression of CD+4CD+25 T cells in peripheral blood in patients with SLE before and after AHSCT

　　Mauchlys W=0.60, P=0.000, used epsilon (Greenhousegeisser) to adjust the degrees of freedom. *P<0.01 vs. before transplantation;#P<0.01 vs. 3 months after transplantation; △P<0.05 vs. 6 months after transplantation

　　图1  SLE患者外周血CD4+CD25+T细胞表达水平的FCM分析（略）

　　Fig.1 FCM analysis of expression of CD+4CD+25 T cells of the peripheral blood in patients with systemic lupus erythematosus

　　2.3  复发组和未复发组患者外周血CD4+CD25+T细胞的表达水平  移植后1年内未见复发，2年后有3例出现复发或可疑复发(简称复发组)，其余12例为未复发组。复发组外周血CD4+CD25+T细胞的表达水平为(5.77±0.91)%，明显低于非复发组的(13.39±1.53)%，差异有统计学意义(F=66.244，P<0.01)。

3  讨论    　　调节性T细胞是最近发现的一个独立的CD4+T细胞亚群，主要功能是抑制其他T细胞的活化，维持自身免疫耐受，其功能异常与许多自身免疫性疾病有密切关系。CD4+CD25+T细胞是一种重要的调节性T细胞，并将其视为调节性T细胞的代名词[4]。    　　我们以前的研究发现SLE患者外周血CD4+CD25+T细胞的表达水平明显低于健康对照组，与SLE的发病有关；在活动期的表达水平与病情活动程度有明显的相关性，对SLE患者的病情活动程度的判断也有一定的价值[5]。    　　大量的动物实验证实，CD4+CD25+T细胞在自身免疫性疾病的发生中具有重要意义。出生后3d切除胸腺(d3Tx)的小鼠易于发生各种自身免疫性疾病，而将CD4+CD25+T细胞输入d3Tx小鼠则可避免自身免疫性疾病的发生。还有研究显示，DBA/2T细胞输入DBA/2×C57BL/6F1小鼠可引起狼疮样综合征，生成高水平的抗dsDNA抗体；而将转化生长因子(TGFβ)在体外诱导的DBA/2小鼠T细胞或CD4+T细胞输入DBA/2×C57BL/6F1小鼠，可明显抑制或防止狼疮样综合征，表现为抗dsDNA抗体和蛋白尿水平显著降低[1,6]。Seo等[7]的研究发现T辅助细胞能激活B淋巴细胞分泌自身抗体，但在CD4+CD25+T细胞存在时，抗DNA抗体B淋巴细胞则不分泌自身抗体，提示CD4+CD25+T细胞可抑制B淋巴细胞自身抗体的产生。以上多项研究结果提示，CD4+CD25+T细胞在抑制自身反应性T、B淋巴细胞的活化增殖及维持自身免疫平衡中发挥重要作用。    　　但是，CD4+CD25+T细胞发挥作用的机制尚未完全明了。其可能的机制有：①分泌或诱导其他细胞分泌TGFβ和(或)白细胞介素(IL)10等抑制性细胞因子；②细胞膜表面高度表达TGFβ，膜表面的TNFβ与靶细胞表面的TGFβ受体结合，发挥对靶细胞的抑制作用，即接触抑制[1,8]。    　　机体内CD4+CD25+T细胞约占CD4+T细胞总数的10%，其数量和活性可满足抑制自身反应性T、B淋巴细胞的活化增殖及维持自身免疫平衡的需要。在SLE患者易感个体中，由于环境、基因异常等因素影响胸腺内CD4+CD25+T细胞的产生，则可导致SLE的发生。我们以前的研究结果显示，不管是活动组还是非活动组，SLE患者外周血CD4+CD25+T细胞的表达水平均明显低于健康对照组[5]。由于CD4+CD25+T细胞的减少，导致机体自身免疫抑制功能的减弱，T辅助细胞活化增强，B淋巴细胞激活因子过多，B淋巴细胞功能亢进产生多种自身抗体，导致一系列免疫系统内的相互作用关系的紊乱，造成多器官受损[9]。    　　自体外周血造血干细胞移植治疗系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的确切机制尚不完全清楚。但可以肯定的是原有的自身免疫性的细胞克隆受到彻底摧毁，重建正常免疫细胞体系是造血干细胞移植成功治疗自身免疫性疾病的关键[1011]。自体外周血造血干细胞移植通过大剂量免疫抑制剂或全身放疗消除自身成熟免疫淋巴细胞，造血干细胞因含大量已醛脱氢酶而抵抗环磷酰胺。预处理过程提供一个避免记忆T细胞影响的窗口，让新的造血干细胞发育成非抗自身的淋巴细胞，诱导对自身抗原的耐受。在患者体内建立免疫耐受后，再把保存的干细胞给患者植入体内，使其重建免疫系统。自身免疫和自身耐受之间是一个动态平衡过程。利用免疫抑制剂削弱自身免疫的力量，通过造血干细胞移植扶持自身耐受的力量，最终使机体恢复正常的免疫平衡系统[12]，从理论上有可能达到治愈自身免疫性疾病的目的。    　　本研究发现移植前SLE患者外周血CD4+CD25+T细胞明显低下，移植后3月后开始出现升高，移植6月后达到正常对照组水平[5]，提示自体外周血造血干细胞移植可促进CD4+CD25+T细胞的表达。由于CD4+CD25+T细胞在维持机体内环境稳定、诱导移植耐受和自身免疫性疾病的发生中发挥重要作用，提示自体外周血造血干细胞移植可通过促进CD4+CD25+T细胞的表达而实现在自身免疫和自身耐受之间建立一个动态平衡。这也可能是自体外周血造血干细胞移植治疗系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的机制之一。　同时，我们的研究还发现，复发组患者外周血CD4+CD25+T细胞的表达水平明显低于非复发组。提示SLE患者外周血CD4+CD25+T细胞的表达水平可能与自体外周血造血干细胞移植治疗的复发有关，对SLE患者自体外周血造血干细胞移植后随访具有一定的的价值。但是如何进一步阐明自体外周血造血干细胞移植对CD4+CD25+T细胞的影响机制和CD4+CD25+T细胞的发挥作用的机制，并增强其数目和活性尚待进一步研究。

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