血红素氧合酶—1与肺缺血再灌注损伤的关系

作者：徐向英作者单位：天津市宝坻区人民医院呼吸内科, 天津 宝坻 301800 【关键词】  血红素氧合酶； 肺缺血； 再灌注损伤　血红素氧合酶(hemeoxygenase,HO)是哺乳动物组织细胞微粒体的一种蛋白酶,是降解血红素为一氧化碳(carbonmonoxide,CO)、铁(Fe)和胆红素的起始酶和限速酶,有3种同功酶［1］:HO-1、HO-2和HO-3。HO-2和HO-3为结构型; HO-1是诱导型,可在缺氧、缺血等多种应激状态下表达［2］。诱导的HO-1对氧化剂、细菌内毒素等诱导的肺损伤具有保护作用［3］。近年来发现它除了具有降解血红素的功能外,还具有组织器官的抗氧化应激保护作用。　　1   HO系统的分子特性　　1.1  HO的一般特性［4~7］:   HO有3种形式的同工酶:HO-1,HO-2和HO-3，在所有HO同工酶中有一个共存的保守基序(motif),它是“HO标记区”,即在酶中间形成一个亲水的血红素催化袋(血红素结合区),位于特定的组氨酸残基中心,袋中包含24个伸展的氨基酸，HO-1是诱导型,被认为是主要的热休克/应激反应蛋白(HSP32),是即早基因产物;HO-2是结构型,属于糖皮质激素调节基因家族中的一员,可由肾上腺皮质激素引起上调,而不受HO-1诱导剂的影响;HO-3也为结构型,活性很低,是作用最弱的血红素催化剂。HO-2,HO-3有一少见的基序,称为”血红素调节基序(hemeregulatorymotif,HRM)”,半胱氨酸形成硫醇血红素配体。　　1.2  HO的催化过程及产物［4,8］ :HO系统在细胞中既有分解代谢又有合成代谢,前者下调细胞血红素和血红蛋白水平,是产生自由基和脂质过氧化最有效的催化剂-血红素分子失活。HO的催化作用需要微粒体还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)-细胞色素P450还原酶协同参与电子转移,它为分子氧的激活和铁的还原提供还原等价物,即HO蛋白结合血红素,并与还原酶一起形成一个短暂的电子传递链,使卟啉环异构体特异性地分离,激活的氧和血红素分子的α中间碳桥相互作用导致在此位置四吡咯环的裂解,形成胆Ⅸα,胆绿素随后在胆绿素还原酶的催化下转变为胆红素,并使碳桥转变为CO,当卟啉环打开时螯合铁也被释放出来。在合成代谢,HO产生生物活性分子:胆色素(胆红素、胆绿素)作为抗氧化剂,CO与cGMP产生有关,铁调节各种基因的表达,包括HO-1本身、转铁蛋白受体、铁蛋白、一氧化氮合酶(NOS)等。　　1.3  HO同工酶表达的调节:HO-1表达受多种因素诱导,包括各种刺激、低氧、血红素、过渡金属、NOSs的一些诱导因子如细菌脂多糖和细胞因子等［9］。在HO-15＇非转录区(UTR)即基因启动子区可测到一些共存于增强子和调节片段的一致序列,包括激活蛋白21结合位点、金属反应片段、抗氧化反应片段、热休克和血红素反应片段、肿瘤基因c2myc/max杂二聚体结合位点、GCbox(Sp1)结合位点［10］,故HO-1可被许多刺激诱导。转录因子与这些特殊位点结合可导致HO-1基因激活,HO-1基因表达的调节在不同器官、不同细胞多数涉及同样的因素。HO-1诱导很快,存在期很短,如暴露于低氧或高温下15min可测到HO-1mRNA升高,1h达高峰(升高30~50倍),24h回到基础正常值。HO-1表达是对所有能导致氧应激的各类型刺激的反应,而HO-2却不能被氧应激诱导,这是因为HO-2 5＇非转录区缺乏可识别的调节片段的一致序列,但已发现HO-2中一个转录子中有糖皮质激素反应片段(glucocorticoid  response element,GRE)存在,在Hela细胞,地塞米松可以时间依赖方式增加HO-2mRNA和蛋白,这种转录作用持续时间长,48h仍可见mRNA增高［11］。　　2  HO-1与缺血/再灌注损伤    缺血/再灌注损伤(IRI)是指组织由于缺血缺氧,于后期呈现损伤,而液体复苏或侧枝循环的代偿等可使循环得以改善,但血供恢复后使原有损伤加重。目前认为,IRI的发生与氧自由基、钙超载、白细胞浸润等有关,人们还发现内皮素、一氧化氮和细胞凋亡等也通过各种途径参与IRI。IRI是普通外科手术尤其是器官移植后造成急性器官衰竭及延迟性器官功能障碍的重要原因。已证实别嘌呤醇、超氧化物歧化酶(SOD)、维生素E、维生素C、丹参等中草药都具有一定的抗IRI作用,但都不能完全消除IRI对组织器官的影响。近年发现HO-1在有害刺激和疾病条件下对机体具有保护作用,特别是HO-1过表达在抗IRI方面具有很好的功效.有研究表明,诱导HO-1过表达可通过抗凋亡途径保护大鼠心脏抵御低温IRI［12］。另有报道,用钴原卟啉(HO-1的诱导剂)诱导或基因疗法引起HO-1过表达可保护大鼠肾脏抵御IRI,提高移植的成功率［13］。此外,许多研究发现HO-1过表达对心脏、肝脏、小肠和肌肉皮瓣等移植模型中的IRI具有细胞保护作用,可维持组织结构、保持器官功能,并能使移植物延长存活时间。

3  HO-1对IRI保护作用的可能机制

　　3.1  抗炎症作用:血红素的分解代谢和HO-1的过表达可直接或间接地抑制炎症连锁反应。缺血/再灌注时,白细胞在微血管内聚集、粘附,并释放氧自由基和炎性介质等,激活蛋白水解酶导致组织损伤及炎症反应，而微血管内皮细胞中的HO-1过表达能减轻氧化损伤和白细胞粘附。HO-1过表达和血红素分解产物对宿主炎症反应瀑布链有重要直接或间接效应。白细胞与它们锚定的相对应物血管内皮细胞在局部炎症反应中起重要作用。伴随着ICAM-1、P-选择素和纤维连接素的上调,血红素可导致血管通透性增加,白细胞在肝、胰、小肠、脾等部位聚集。HO-1系统通过调节内皮细胞粘附分子和趋化因子影响中性粒细胞和单核细胞的归巢。HO-1可减轻微血管内皮细胞氧化损伤及白细胞的粘附,Vacharajani等［14］观察到在内毒素模型中,HO-1和胆绿素通过改变肺、肾、肝、小肠P-选择素和E-选择素调节白细胞浸润,进一步证明了HO-1及反应产物胆红素的保护作用。尽管诱导型NO合酶(iNOS)的作用在IRI中常有争议,但iNOS的过度表达常与IRI有关。iNOS含有血红素,HO-1可以下调iNOS-NO系统的表达。CO也可抑制已存在的iNOS活性,铁可进一步下调iNOS转录。有学者表明［15］，在肝IRI中,HO-1发挥细胞保护作用时常伴随着明显的iNOS表达下调。已往研究［16］表明,HO-1抑制白细胞在心肌、肝和肾移植物中的浸润。Otterbein报道［17］，低浓度CO(250ppm)在体内、外选择性下调LPS诱导的前炎症细胞因子(TNF-α、IL-1β、MIP-1)的表达,而增加IL-10表达。Lee等［18］观察到，IL-10通过上调HO-1表达及CO生成增多从而激活P38MAPK途径发挥抗炎症作用。

　　3.2  调节细胞周期:缺血以及再灌注可引起细胞凋亡。大量的证据显示,HO-1过表达对IRI的保护作用都伴有凋亡的降低。许多证据表明［19~21］,HO-1或CO通过抗凋亡途径发挥器官缺血再灌注、高氧或低氧所致的肺损伤中的保护作用。最近,Brouard等［22］表明,HO-1在培养的内皮细胞中通过CO激活P38MAPK途径而发挥抗凋亡作用。另一方面,持续低氧促进血管重构,表现为血管平滑肌细胞(VSMC)的增生迁移,动脉壁细胞外基质沉积。作为保护措施的CO可限制IRI中过度的VSMC增生［23］。Duckers等［24］显示HO-1可上调周期素激酶抑制物P21Cipl的表达,抑制体内、外VSMC生长,使其停滞在G1/S期。在c-myc,cyclin和DNA聚合酶基因的调控下,E2f-1在有序的细胞周期进程中是必需的［25］。增加培养VSMC中C产量或把培养的VSMC置于外源性CO中常显示伴随着E2f-1的抑制,VSMC的生长反应减缓。

　　3.3  抗氧化作用 ：HO-1及其催化血红素分解的产物在IRI中具有抗氧化作用。在再灌注早期阶段,许多细胞都可被自由基(oxygenfreeradica,OFR)破坏,产生大量的游离血红蛋白和血红素,直接攻击膜脂质双分子、细胞骨架、金属酶、DNA,还产生更多OFR。血红素的降解是HO-1系统提供细胞保护关键的一步。许多应用血红素结合蛋白hemopexin(HPX)的资料都支持这个论点。HPX是分子质量为60ku的血浆糖蛋白,以1:1摩尔分子的比例结合血红素,通过受体介导细胞内吞HPX。从而输送血红素到细胞内部。细胞摄取血红素后,HP转变为阿扑血红素结合蛋白,完整地返回到循环中。有研究证明应用HPX后可减轻大鼠肝缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusioninjury,IRI),减少OFR产生。    　　缺血时,线粒体受损,氧化磷酸化停止,ATP下降,组织以无氧酵解为主。这样,在再灌注早期,对组织的氧供要远远超过实际的需要，过多的氧就作为氧化酶如黄嘌呤氧化酶和细胞色素P-450的底物,这些氧化酶会产生具有损伤性的氧自由基。而涉及HO-1的氧化步骤要消耗3分子O2。因此,HO-1消耗氧分子将在IRI中通过减少氧自由基的产生来间接地提供细胞保护作用。另外,胆绿素和其还原产物胆红素能清除活性氧,它们被认为是内源性抗氧化剂,可以保护细胞抵抗氧化损伤。在生理O2浓度下,胆绿素和胆红素可阻止不饱和脂肪酸的氧化,其作用与维生素E一样有效。铁是HO-1催化血红素分解的又一产物,它能诱导铁蛋白的合成,后者可减少活性氧的产生。

3.4  维持微循环：缺血及再灌注过程中,氧自由基和血小板激活因子等诱导白细胞和微血管内皮细胞中粘附分子的表达,引起白细胞在微血管内聚集、粘附,堵塞微循环,造成组织损伤。HO-1下游主要调节剂CO,通过与NO相似的机制,结合可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)上的血红素,通过血红素与铁的结合与解离,引起构象改变,激活sGC,增加平滑肌细胞内cGMP浓度,引起平滑肌舒张［26］,维持微循环血流。CO尚可通过cGMP途径抑制血小板聚集［27］,在肺低氧模型中,吸入CO抑制肺动脉血栓形成过程中纤维蛋白溶解轴的关键因子纤溶酶原激活抑制物-1(PAI-1),保持血流通畅。

　　4  HO与呼吸系统疾病

    活性氧族(reactive oxygen species,ROS)生成增加可导致许多肺部疾病,包括成人呼吸窘迫综合征。持续高氧使ROS过度产生,破坏肺部毛细血管内皮,导致肺出血、 间质及肺泡水肿、炎性细胞浸润。48h高氧(＞95%)则可引起肺水肿、胸腔积液。经气管给予HO—1的底物血红蛋白的大鼠与对照组相比，胸腔积液量及肺湿干重比均下降，提示HO-1诱导可保护肺部免受高氧损伤 ［28］。另外，在支气管哮喘患者的气道中，某些介导炎症反应的细胞因子如白介素、肿瘤坏死因子α、γ干扰素等含量增高，可强有力地诱导HO-1。在患者痰中分离出来的气道巨噬细胞内HO-1呈高表达。给予皮质类固醇治疗后，HO-1诱导被抑制，提示HO-1对慢性炎症性肺部疾病可能有保护作用 ［29］。

　　5  HO-1与肺缺血再灌注损伤

    肺I/R可引起急性肺损伤,由于中性粒细胞聚集、激活,生成大量ROS及白三烯(LTs)、TNF-2、IL-1等炎性介质,引起肺泡毛细血管膜损伤,导致肺水肿,可发展为ARDS。使大鼠吸入高浓度氧(95%),复制肺损伤模型,发现大鼠肺HO-1mRNA及酶活性显著增高。用免疫组化方法检测HO-1,发现定位于气管肺泡上皮、间质及炎性细胞。体外实验将不同类型的细胞(上皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞)暴露于95%O2和5%CO2,细胞中HO-1表达增加,同时伴有转录因子AP-1活性上调及c-jun、c-fos表达增加,提示这些转录因子在HO-1基因表达中起作用。利用LPS或臭氧处理大鼠巨噬细胞也可致HO-1表达上调。转染人HO-1基因的大鼠肺微血管内皮细胞高表达HO-1,与未转染的细胞相比,对H2O2毒性有了相当程度的抵抗力。Suttner等［30］将大鼠胎肺细胞转染HO-1系统后,暴露于95%O2和5%CO2 24h,高表达HO-1的细胞死亡减少.以上说明HO/CO系统在急性肺损伤中起重要作用。低浓度CO或用气管滴注腺相关病毒携带的HO-1基因,使肺高表达HO-1后吸入高浓度氧,大鼠气道和间质炎症及肺水肿消失,同时气道的嗜中性粒细胞减少,肺凋亡指数下降,这说明HO-1的表达和外源性CO可能对于急性肺损伤有防治作用。经气道给予Hb促进肺组织HO-1基因的表达,然后将大鼠置于100%O2中60h,结果与对照组比较,前者的胸膜渗出及肺湿/干重比等急性肺损伤指标较轻,提示通过人为诱导HO/CO表达系统上调可以防治急性肺损伤。Fujita等［19］证明HO-1(2/2)小鼠表现了严重的肺缺血性损伤,而吸入CO可减轻损伤程度。CO通过激活sGC,抑制低氧诱导单核吞噬细胞表达PAI-1,减少微循环中的纤维蛋白沉积。而在PAI-1基因缺失的小鼠中,CO介导的这种保护作用消失,从而证明CO保护作用的发挥与CO参与纤溶反应链解抑制有关。Zhang等［31］肺I/R模型中发现,与假手术对照组相比,HO-1mRNA在I/R组显著增加。他们又观察到各种血管细胞在缺氧24h后复氧30~60min,HO-1mRNA诱导增加,同时观察到MAPK的三个亚家族都被激活。利用基因转染方法,表明HO-1在肺I/R中的诱导涉及MAPK的上游通路及需要HO-1的启动区和E1增强了参与。他们利用选择性P38MAPK抑制剂证实CO抑制Fas/FasL的表达,进而抑制Caspase3,8,9的激活,poly-(ADP-ribose)polymerase(PARP)裂解及线粒体细胞色素的释放,选择性调节Bcl-2家族蛋白成员,增加抗凋亡Bcl-2家族蛋白Bcl-XL、Bcl-2的表达［32,33］。Zhou［34］、Ito［35］等还提示肺HO-1诱导可提供远隔脏器I/R致肺损伤的保护作用。

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