骨髓间充质干细胞与基因治疗

作者:王广军 作者单位：泰山医学院，山东 泰安 271000

 【关键词】  骨髓间充质干细胞 基因治疗 靶细胞

　　1  骨髓间充质干细胞的概念

　　干细胞是具有无限或较长期的自我更新能力并能产生至少一种高度分化细胞的细胞。早在1867年，德国病理学家Cohnbeim在研究伤口愈合时首次提出骨髓中存在间充质干细胞(MSCs  Mesenchymal Stem Cells)；1987年Friendenstein［1］发现骨髓中某种单核细胞在一定条件下可发育成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞等，这些间质细胞都源于中胚层，因而将这种单核细胞称为间充质干细胞MSCs（Mesenchymal Stem Cells）。将源于骨髓的间充质干细胞称为骨髓间充质干细胞BMSCs ( Bone Mesenchymal Stem Cells),它是存在于骨髓中的另一种非造血干细胞，可发育成骨、软骨、脂肪、肌肉和内皮细胞等细胞，无发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制，属于多能成体干细胞。它在骨髓中以低密度存在，约104～  105个单核细胞中存在一个BMSCs。

　　2  骨髓间充质干细胞的分离纯化

　　BMSCs在骨髓中含量低，它的分离纯化问题一直是BMSCs研究中的一个重要但至今还没有完全解决的问题。目前分离纯化BMSCs的方法有3种［2］：①贴壁法:根据它在塑料培养瓶中易贴壁生长而造血系细胞悬浮生长的特点对二者进行分离的方法。该法操作容易,设备简单，不易发生污染，对细胞干扰小，但所得BMSCs纯度不足，需要多次换液传代，才能获得较高纯度的BMSCs。②密度梯度离心法：BMSCs与其他细胞密度不同，根据沉降作用原理，将其置于某一梯度的介质中离心以除去其他细胞。离心法可获得相对较高纯度的细胞，但对细胞活性干扰较大。③根据细胞表面的一些特殊标记，用各种单克隆抗体进行阳性或阴性筛选，因BMSCs无特殊的表面标记，只好采用多种标记联合鉴定的方法进行鉴定。目前采用的方法主要有：流式细胞仪分选法、免疫溶解法、平面黏附分离法和免疫磁珠分离法。流式细胞仪分选法较常用，但对细胞的活性影响较大且费用较高。

　　3  骨髓间充质干细胞的生物特性

　　3．1  光镜下的形态特征

　　接种后BMSCs一开始为圆形，折光性较强，2～4 h后开始贴壁，以后贴壁细胞逐渐增加，24～36 h后不再增加。48～72 h后贴壁细胞开始增殖，此时细胞多为梭形，少数为圆形。一周左右细胞进入对数增殖期，细胞以梭形为主，少数为圆形，多边形。2～3周细胞融合进入生长平台期，细胞排列具有方向性，细胞以梭形为主，有1～2个细胞核 ，圆形居中，有1～2个核仁。

　　传代以后细胞贴壁速度增快，12 h内可完全贴壁，生长速度也较原代时加快，细胞多呈梭形，7～10天内细胞完全融合，排列具有方向性与原代相似。

　　随着传代次数的增加细胞生长速度有所减缓，一般8～12代后细胞生长速度开始减慢，有衰老的趋势，三角形、多边形细胞增多，胞质内空泡及颗粒状物质增加。过度地传代有损细胞的功能，细胞表现为明显衰老或凋亡征兆。

　　3．2  电镜下的形态特征

　　电镜下观察：BMSCs细胞核大，形态多样，以椭圆形或类圆形为主，可见1～2个核仁，核浆比例大，胞浆内可见分泌小泡，胞质中细胞器丰富，如核糖体、线粒体、粗面内质网、高尔基体等，提示这种细胞具有较强的蛋白质合成能力，是其分泌多种生长因子、维持自身分化增殖的物质结构基础［3］。在电镜下原代与传代细胞无区别。

　　3．3  骨髓间充质干细胞增殖特性

　　BMSCs因具有较强的自我增殖能力，而成为研究的重点。干细胞的增殖方式通常有两种［4］：一种是不对称分裂，即一个干细胞分裂成一个干细胞和一个定向祖细胞，另一种是干细胞按一定概率分裂成立两个干细胞或定向祖细胞。BMSCs与其他细胞一样在体外培养时要经历生长滞缓期、对数增长期和平台期。Friendenstein［1］的研究表明BMSCs在体外连续培养20～30个细胞周期后仍可保持较强的增殖能力。BMSCs在12代内可保持正常核型及端粒酶活性［5］。5×105个BMSCs经12代扩增其细胞数可达2.3×109，约扩增4.6×104倍。在同样培养条件下BMSCs的生长曲线明显高于成骨细胞的生长曲线［6］。有人测得BMSCs的平均倍增时间约为46 h。体外培养的BMSCs绝大部分处于G0/G1期，只有少部分处于S+G2+M期，表明BMSCs具有较强的增殖潜能。电镜下可看到BMSCs具有丰富的核糖体、粗面内质网、高尔基体、线粒体，这是它具有较强自我增殖能力的物质基础。BMSCs具有较强的自我增殖能力，使体内低密度存在的BMSCs通过体外培养实现数目扩增的设想成为可能，在基因治疗时可以提供大量的靶细胞，而且可减少或避免多次移植手术。目前对于BMSCs的自我增殖机制尚不清楚，一些学者认为Notch家族基因受体的配体通过信号转导途径能调节干细胞的增殖及维持干细胞的未分化机制。

3．4  骨髓间充质干细胞分化特性

　　BMSCs具有向骨、脂肪、软骨、神经、血管内皮细胞、肝细胞、肾脏细胞、胰岛细胞分化的能力［7～9］。BMSCs的体外诱导方法目前尚无完全统一的标准方案，在BMSCs体外诱导实验中所用的诱导物质按其作用原理大致分两类［10］，一类可使其产生轻度的可逆性损伤，如诱导BMSCs向脂肪细胞分化的地塞米松，1甲基3异丁基黄嘌呤等。另一类可与BMSCs表面受体结合从而介导分化，如多肽生长因子等。

　　3．4．1  骨髓间充质干细胞分化机制  组织干细胞分化的机制尚不清楚，初步认为与基因编码的转录因子和细胞外信号有关［11］。一些学者［12］认为干细胞所处的微环境对干细胞的分化起调节作用，即干细胞的分化受细胞与细胞、细胞与细胞外基质相互作用的影响。细胞因子在传递细胞与细胞、细胞与细胞基质间的信息中起重要作用，如白介素(IL)、干细胞生长因子(CSF)、表皮细胞生长因子(EGF)、成纤维细胞因子(FGF)、肝细胞生长因子（HGF）等可调节干细胞的自我更新、诱导或抑制其增殖和定向分化。基础的营养条件、某些激素、细胞密度、生长因子都影响BMSCs的分化。

　　通过结合细胞培养技术和基因组研究方法，如DNA微列阵技术，有望确认干细胞的本质及控制其分化的基因。

　　3．4．2  对横向分化的质疑

　　对于BMSCs的横向分化的争论从来没停止过，近来反对的声音要占上风。以前对于BMSCs向神经元分化的报道比比皆是、屡见不鲜，但所有实验在鉴定神经元时所使用的方法不外乎：①形态学观察，即诱导后的细胞形态与神经元相似。② Nestin蛋白阳性。仅从这两方面来证明一种细胞是神经元细胞是不严谨的，至今还没有观察到“神经元样细胞”具有神经细胞的电生理特性，也无人能证明它具有神经细胞的功能，也无人能证实BMSCs与周围细胞发生信号联系、能发挥神经元的功能。PLu等［13］等认为：所谓BMSCs向神经元细胞的横向分化只不过是它在外部因素作用下的变形而已，变形由以下原因引起：①BMSCs细胞胞体收缩。②BMSCs的细胞骨架解体。他们还发现在BMSCs诱导前后“两种”细胞都是Nestin蛋白阳性。

　　3．5  骨髓间充质干细胞免疫特性

　　BMSCs是一种原始的细胞不表达相关细胞表面标志如I、II型胶原、碱性磷酸酶，也不表达造血干细胞的表面标志如脂多糖受体CD14、CD34及白细胞表面抗原CD45,但表达SH2、SH3、CD29、CD44、CD90、CD106、CD120A、CD124、CD166和多种表面蛋白。BMSC不表达MHCII和T细胞共刺激因子如B71、B72、CD40、CD40L［14］。主要组织相融复合体（MHC）基因为一组编码细胞表面蛋白分子或抗原的基因，他们分别编码和产生与免疫应答及免疫识别有关的蛋白分子，在机体对外来抗原的免疫应答中，T细胞只有在识别了抗原细胞上的MHCI类抗原后，才能对抗原产生免疫应答。由于T淋巴细胞对BMSCs的表面标志识别能力差，因而BMSCs易于逃避机体的免役监视。此外BMSCs还可抑制T淋巴细胞对异体抗原或非特异性有丝分裂抗原增殖反应及对自身多肽的激活反应。 Barthlomew15等给狒狒静脉注射BMSCs，发现这样可使异体移植的皮瓣存活期明显延长，其疗效可与CsA联合抗CD80单抗治疗相当，证明BMSCs具有诱导免疫耐受作用。 BMSCs可分泌TGFB、HGF等细胞因子阻断Thl细胞启动的炎症反应，具有免疫调节作用。

　　BMSCs的低免疫原性使得它在异体移植时产生的免疫排斥反应较轻微，为它在宿主中的生存提供了可能。

　　3．6  骨髓间充质干细胞在宿主脑内的生存情况

　　一种理想的靶细胞要能在宿主中长期存活、能与宿主细胞相互作用、建立细胞间通信，以便导入基因得以长期表达而长久地发挥其治疗作用并减少移植次数、减少患者痛苦及损伤。BMSCs在宿主脑中的命运如何？为此人们作了大量的研究。BMSCs具有穿越血脑屏障的能力，能在脑组织中长期生存，定向迁移，有的甚至观察到BMSCs分化为“神经元样细胞、神经胶质细胞”。国内学者侯等［16］在实验中观察到人BMSCs可以在大鼠脑中存活10周以上，并发生迁移，同时表达人源性神经细胞抗原如NF、GFAP。他们观察到植入到大鼠脑内的BMSCs很长一段时间内保持梭形，认为BMSCs可长期存活，但认为它不能与宿主细胞进行整合。国外学者Kopen［17］将标记的BMSCs注入一只出生三天的小鼠的侧脑室中，12天后BMSCs出现在小鼠的前脑及小脑中而不破坏正常脑组织结构，有些分化为“星形胶质细胞样细胞”，并表达星形胶质细胞的特异性蛋白（GFAP）。BMSCs能否与周围细胞建立联系进行整合发挥神经细胞的功能，大家各执一词，莫衷一是，尚无定论。虽然如此，但有一点是公认的：BMSCs可以在鼠脑中长期生存并能保持其生物学特性。BMSCs能在宿主中长期生存，这为外源性基因的长期表达提供了一个良好的平台。

3．7  骨髓间充质干细胞对胶质瘤细胞的趋向性

　　神经干细胞NSCs(Neural Stem Cells)一个引人注目的特性是：它对肿瘤细胞具有“趋向性、追踪能力”。将NSCs移植于鼠脑组织中肿瘤外侧时，NSCs可长距离地向肿瘤定向迁移，最终分布于瘤体中及肿瘤与正常脑组织的交界处。如果把NSCs移植于瘤体中，除可见NSCs遍布于瘤体中外，还可见NSCs［18］追随扩散的瘤细胞。BMSCs是否具有同样的能力呢?为此Akira［20］等做了裸鼠U87胶质瘤细胞荷瘤模型，然后在瘤体外侧3mm处及瘤体中和对侧大脑半球注射用绿色荧光蛋白(GFP)标记的BMSCs,术后14天后取病理切片，在荧光显微镜下证实BMSCs除遍布于瘤体外还追踪扩散的肿瘤细胞。可见BMSCs同样具有对肿瘤细胞的“趋向性、追踪能力”。对于BMSCs的迁移机制及趋向性机制的研究刚起步，目前尚无大的进展，也未见详实的具有说服力的报道。BMSCs在大鼠脑中的命运由其自身的生物学特性及所处的脑内微环境所决定，脑中的一些细胞因子、黏附分子与它的迁移有关。文献［19］记载胶质瘤与受损的组织相似可以表达表皮生长因子（EGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、血小板衍生细胞因子（PDGF）基质细胞衍生因子(SDF1α), 这些因子促进BMSCs在脑内迁移，而BMSCs细胞表面有EGF、PDGF等受体表达。Akira［20］等认为BMSCs参与了胶质瘤间质的形成，它对胶质瘤的生长有促进作用，MSCs向胶质瘤迁移为瘤细胞的生长提供了一个有利的微环境。

　　3．8  骨髓间充质干细胞基因治疗的实验

　　BMSCs易于转染外源性基因且有较高的转染率。Harrington K［21］报道BMSCs易于被逆转录病毒转染，其转染率可达50%～80%，并且具有定向达靶位而避免非特异性黏附，避免免疫激活，从而大大提高治疗基因表达产物的浓度使疗效得以提高。随着研究的深入，人们把BMSCs转染外源性遗传物质后用于体内实验：有人将神经生长因子(NGF)、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）等能促进神经细胞生长的因子导入BMSCs中，然后将其移植到人脑中来改善帕金森病的临床症状，取得了一定疗效。转染了人IL3基因的小鼠BMSCs可稳定地表达IL3至少4个月，可持续检查到IL3达8周。通过反转录病毒转染了人IL3基因和绿色荧光蛋白（GFP）基因的hBMSCs ,在体外持续表达IL3、GFP 6个月以上，在小鼠体内表达3个月以上。Studenty［22］将BMSCs转染IFNB后与恶性黑色素瘤细胞共同移植于小鼠体内，发现BMSCs特异性地浸润肿瘤组织，表现出了BMSCs对肿瘤细胞的趋向性,而且BMSCs还表达IFNβ来抑制肿瘤的生长。以上实验说明BMSCs是一种良好的载体可以在宿主脑内表达治疗性蛋白。

　　4  骨髓间充质干细胞的致瘤性

　　目前对BMSCs的“自我增殖”的激活与关闭机制尚不清楚，对植入脑组织后的BMSCs的生存机制、生存状态及它与周围的神经细胞多大程度上建立联系尚不清楚。几乎所有研究都处在“形态学”观察这个表浅的层次上，还不能从生理、生化等角度系统完整地说明其中的奥妙。BMSCs具有较强的自我增殖能力，理论上应有潜在的致瘤性。尽管如此从以往的实验来看BMSCs移植后是安全的少有致瘤的报道。对于BMSCs安全性的评估，需要用更接近人类生理特性的灵长类动物来进行长时间的观察后才能取得令人信服的数据和结论。

　　5  骨髓间充质干细胞基因治疗的展望

　　在基因治疗时选择靶细胞的原则是：①必须较坚固，足以耐受各种处理，便于从人体分离又便于输回体内。②具有增殖能力，生命周期较长，能存活几个月到几年，甚至终生。③易于外源性遗传物质的转化。④在选用反转录病毒载体时，目的基因的表达最好使用具有组织特异性的靶细胞。目前还没有任何一种细胞能完全达到上述要求。相对与其它细胞BMSCs因制备较易、具备有较强的自我增殖能力、稳定的生物学性状、低免疫原性、能在宿主脑中生存较长时间、易于转染外源性基因且有较高的转染率、对肿瘤细胞具有趋向性而成为一种较有希望的基因治疗的靶细胞。

目前干细胞的研究正由狂热趋向理智，国际上研究的重点集中在灵长类动物实验上，希望能通过系统地筛选细胞、调整分化程度等来探索干细胞移植用于临床的方法。

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