GFP作为报道基因在研究WT1基因调控元件中的应用

GFP作为报道基因在研究WT1基因调控元件中的应用作者：胡绍燕　陈子兴，赵晔，傅铮铮，何军，岑建农，谷敏    作者单位：苏州大学附属第一医院 江苏省血液病研究所，苏州, 215006    【摘要】  本研究调查EGFP基因作为报道基因在研究WT1基因调控功能中应用的可行性。利用基因重组技术分别将WT1基因启动子和增强子的功能片段构建到质粒pEGFP1载体中，转化感受态E.coli菌细胞，筛选了阳性转化菌落，通过限制性酶切鉴定重组质粒插入片段正确的菌落，抽提重组质粒DNA；同时将重组质粒转染K562细胞，通过荧光显微镜检测重组质粒的功能。结果表明： 通过基因重组技术分别构建了含有WT1基因启动子的载体（pEWP）和含有WT1基因启动子和增强子的载体（pEWPE、pEWPA 和pEWPD）。转染48小时后，pEWP、pEWPE、pEWPA 和pEWPD的K562细胞在荧光显微镜下能够显示荧光，而转染了空载体pEGFP1的K562细胞未出现荧光。结论： EGFP基因作为报道基因可以用于WT1基因调控功能的研究，为进一步开展基因治疗创造了条件。    【关键词】  EGFP； WT1基因；启动子；增强子；K562细胞　　Application of EGFP as  Reporter Gene in Study of WT1 Regulation Elements    HU ShaoYan*, CHEN ZiXing, ZHAO Ye, FU Zheng Zheng, HE Jun, CEN JianNnong， GU Min   Jiangsu Institute of Hematology, The First Affiliated Hospital of Suzhou University, Suzhou  215006, China    Abstract    In order to investigate the feasibility of using  EGFP as a reporter gene in WT1 transcriptional regulation study.  WT1 promoter and enhancer were ligated into the vector pEGFP1  by recombinant DNA technique and confirmed by restriction enzymes digestion. The resultant constructs were transfected into K562 cell line by DMRIEC reagent and    the function of these WT1 gene elements   was detected by  using a fluorescent microscope after transfection for 48 hours. The results indicated that  the recombinant vectors, pEWP containing WT1 promoter, and pEWPE, pEWPA and pEWPD harboring both WT1 enhancer and promoter, had been successfully constructed. Fluorescence was observed in K562 cells transfected by pEWP, pEWPE, pEWPA and pEWPD, while no fluorescence could be detected in cells transfected by pEGFP1. It is concluded that EGFP gene as a reporter gene can be applied to  the WT1 transcriptional regulation study, which provides the basis  for gene therapy.    Key words    EGFP; Wilms′  tumor gene;  promoter;  enhancer;  K562 cell    J Exp Hematol 2007; 15(3):599-602    WT1基因是一个参与转录调控的双相调节子，它与各种造血调控因子相互作用，在白血病发病过程中起重要作用。近十几年的研究证实，80％-90％的急性白血病中WT1基因高表达［1，2］，且随着病情的进展表达增高，被认为是一种“泛白血病”标志［3］，有可能成为白血病基因治疗和特异性免疫治疗的新靶点。绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因及其载体是近年来研究活细胞中基因表达和蛋白定位的新型报道基因，已成功表达于多种原核生物和真核生物［4］。    本研究将WT1基因启动子、增强子片段连接到携带突变型绿色荧光蛋白报道基因而自身无启动子、增强子的载体pEGFP1中，通过检测瞬时转染后K562细胞的荧光强度以确定重组载体用于研究WT1基因转录调控功能的可行性，进而为研究WT1启动子和增强子用于白血病的基因治疗奠定基础。    材料和方法    主要材料    携带WT1启动子和增强子的质粒pCB.7e250（-）由美国Fraizer GC博士惠赠；pEGFP1载体购自 Becton  Dickinson Biosciences公司。 E. coli  DH5α为本实验室保存。琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒为Qiagen公司产品；T4 DNA连接酶和限制性核酸内切酶BamHⅠ、HindⅢ、PstⅠ、SalⅠ、NotⅠ、HpaⅠ为MBI公司产品，AflⅡ和StuⅠ为TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司产品；小牛肠碱性磷酸酶（CIAP）为Promega公司产品；Klenow片段为上海华美生物公司产品；PEG8000为上海生工公司产品。蛋白酶K、DNA分子量标准λ/HindⅢ、100 bp DNA Ladder、100 bp DNA plus Ladder、pUC19/MspⅠ购自MBI公司。卡那霉素、Xgal和IPTG为Sigma公司产品。脂质体DMRIEC为Invitrogen公司产品。荧光显微镜为Leica Q550CW型。    重组载体构建    WT1基因启动子的构建  取2 μg  pCB.7e250（-）进行HindⅢ/PstⅠ双酶切，反应产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳，切下WT1基因启动子片段，按琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒按说明书纯化凝胶中的DNA片段。WT1启动子与经过HindⅢ/PstⅠ双酶切的pUC18载体连接、测序，证实WT1基因启动子序列正确。再将WT1启动子与经过HindⅢ/PstⅠ双酶切的pEGFP1载体连接。    WT1基因增强子的构建  取20 μg  pCB.7e250（-）进行BamHⅠ酶切，纯化的DNA片段与pUC18质粒连接、测序。将切下的WT1增强子片段分别插入载体pEWP的不同位点（MCS多克隆位点，NotⅠ位点和AflⅡ位点），通过粘端连接将WT1增强子与经BamHⅠ酶切后的pEWP连接，使WT1增强子连接到pEWP的多克隆位点上，通过平端连接将补平后WT1增强子分别连接到补平且去5′ 磷酸化的pEWP    AflⅡ位点和NotⅠ位点上实现。    细菌转化    利用电穿孔技术将上述重组质粒转化到E.coli DH5α感受态细胞中，取250 μl的电击转化细菌铺于含30 μg/ml卡那霉素的LB培养基的琼脂板上，37℃倒置培养16-20小时。挑取阳性菌落扩大培养后，提取质粒进行酶切鉴定。    细胞培养与转染    白血病细胞株K562细胞于37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养。含体积分数15%胎牛血清（FCS）（杭州四季青公司）的RPMI 1640（Gibco/BRL）完全培养液进行常规培养。将4.0 μl的DMRIEC脂质体稀释于100 μl  OPTIMEM无血清培养液中，同时取另1份100 μl  OPTIMEMI无血清培养液稀释0.8 μg重组质粒，5分钟后将二者混合，室温放置45分钟以形成DNA脂质体混合物。用OPTIMEM无血清培养液调整K562细胞浓度，使其达到8×106/ml，每孔加入50 μl（相当于4×105细胞），再将DNA脂质体混合物滴入，5小时后补充40  μl胎牛血清和1 ml  RPMI 1640完全培养液继续培养。于48小时用Leica Q550CW荧光显微镜在FITC滤光镜激发下观察细胞的荧光强度。结    果    WT1基因启动子的构建与鉴定    pUC18/WT1启动子连接与鉴定  1 μg  pUC18/WT1启动子连接产物进行HindⅢ/PstⅠ双酶切，经1.2%的琼脂糖凝胶电泳，得到两个片段，大小分别为2.6 kb和652 bp（图1）。 测序结果显示WT1启动子的序列正确。    pEWP连接与鉴定  WT1启动子与空载体pEGFP1连接，形成重组质粒pEWP，进行HindⅢ/PstⅠ双酶切，经1.2%的琼脂糖凝胶电泳，得到两个片段，大小分别为4.2 kb和652 bp（图2）。    WT1增强子的构建与鉴定    pUC18/WT1增强子连接与鉴定  20 μg pCB.7e250（-）进行BamHⅠ酶切，经1.5%的琼脂糖凝胶电泳，得到1个258 bp的片段（图3）。连接到pUC18质粒进行测序，证实序列正确。    pEWP/WT1增强子连接与鉴定  在pEWP质粒多克隆位点BamHⅠ处插入WT1增强子，即pEWPE，进行BamHⅠ酶切，经1.2%的琼脂糖凝胶电泳，分别得到一个4.9 kb和258 bp的片段（图4）。    在pEWP质粒NotⅠ位点插入WT1增强子，即pEWPD，进行SalⅠ和HpaⅠ双酶切，经1.2%的琼脂糖凝胶电泳，得到1个1.14 kb和3.9 kb的片段，pEWPE也是如此（图5）。    在pEWP质粒AflⅡ位点插入WT1增强子，即pEWPA，分别进行HpaⅠ和StuⅠ双酶切，经1.2%的琼脂糖凝胶电泳，得到3个片段，分别3.2 kb、1.1 kb和183 bp（图6）。    增强子方向的鉴定  由于258 bp的增强子片段中在194 bp和64 bp处也存在一个StuⅠ酶切位点，因此双酶切后产生3个片段。经过计算后确定，pEWPE质粒中增强子是正向插入（大小依次为3.0 kb、1.058 kb和978 bp），而pEWPA为反向插入（图6）。    具体结构图见图7。    重组载体功能测定    转染K562细胞48小时后荧光显微镜下观察，可以看到部分转染pEWP、pEWPE、pEWPA和pEWPD重组质粒的K562细胞有荧光，而转染空载体pEGFP1的K562细胞不发荧光（图8）。这说明重组质粒中的WT1基因启动子或启动子与增强子能够调控EGFP基因表达EGFP蛋白，以携带pEWPA重组质粒的K562细胞发出的荧光最强。    Figure 8.  Fluorescence in  transfected by K562 cells. A: K562 cells transfected by pEGFP1. B: K562 cells transfected by pEWP. C: K562 cells transfected by pEWPE. D: K562 cells transfected by pEWPA. E: K562 cells transfected by pEWPD.讨    论    基因的转录调控是一个复杂而又精细的过程，而携带不同报道基因的真核表达载体的构建可能对研究基因的转录调控有着重要的影响，因而会导致不同结论［5］。以往常用的报道基因如β半乳糖苷酶基因、荧光素酶基因等的产物本身不能产生可检测的信号，必须作用于底物，通过催化底物发生特定的化学反应才能产生可检测的生成物。同时，由于采取瞬时转染，需要同时共转染第二个报道基因，作为内参照标化转染效率，因此会造成系统性误差而影响结果的评判［6］。以EGFP表达系统作为报道基因用于研究基因调控元件的转录活性能够同时检测转染效率和荧光强度，不需要共转染第二个报道基因，这不但消除了两个启动子之间的竞争作用，而且所需要的质粒较检测CAT所需要的质粒少，同时用流式细胞仪（FACS）检测EGFP的绿色荧光强度，不但检测方便、迅速、重复性好，而且可以进行定量分析［7］，因此将被越来越多的学者所使用。    本研究所采用的载体pEGFP1基因编码1个突变型绿色荧光蛋白，因其产物在第64位氨基酸发生Phe →Leu突变与第65位氨基酸发生Ser →Thr突变，所以其产物在哺乳动物细胞中更容易表达，所产生的绿色荧光蛋白强度更高。无需任何底物，在流式细胞仪上可以直接检测，免除了生化检查的繁琐，且该蛋白十分稳定，在各种极端条件下(热、酸、碱、变性剂) 均不受影响，将WT1启动子克隆至携带无自身启动子、增强子的突变型绿色荧光蛋白报道基因载体pEGFP1中，构建了具有WT1基因启动子携带突变型绿色荧光蛋白报道基因pEWP载体。理论上一般认为，增强子对启动子的增强作用与增强子所在的位置无关，与增强子的方向也无关。为此，我们在载体的多克隆位点BamH Ⅰ处直接加入经BamH Ⅰ酶切的增强子片段，并参照文献［8］，在Afl Ⅱ位点将增强子片段平端连接，此外，我们在EGFP终止密码后的Not Ⅰ位点将增强子片段也进行平端连接，分别称为pEWPE、pEWPA与pEWPD。本研究不但为评估WT1基因启动子和增强子对WT1基因转录调控的组织特异性奠定基础，而且也进一步评估了WT1基因增强子的位置效应，同时为评估WT1启动子、增强子用于白血病基因治疗的可行性研究打下基础。如果结果是肯定的，即可将EGFP 换成一种促进肿瘤细胞凋亡或杀伤肿瘤细胞的基因，以尝试对WT1高表达的白血病细胞进行特异性杀伤而不损伤正常细胞的基因治疗。【参考文献】  1 Bergmann L, Maurer U, Weidmann E. Wilms tumor gene expression in acute myeloid leukemias. Leuk Lymphoma，1997; 25: 435- 443  2 Bergmann L, Miething C, Maurer U, et al. High levels of Wilmstumor gene (WT1) mRNA in acute myeloid leukemias are associated with a worse longterm outcome. Blood, 1997; 90: 1217-1225  3 Menssen HD, Siehl JM, Thiel E. Wilms tumor gene (WT1) expression as a panleukemic marker. Int J Hematol, 2002; 76: 103-109  4 Fortinea N, TrieuCuota P, Gaillota O, et al. Optimization of green fluorescent protein expression vectors for in vitro and in vivo detection of Listeria monocytogenes. Res Microbiol, 2000; 151: 353-360  5 Reddy JC, Hosono S, Licht JD. The Transcriptional effect of WT1 is modulated by choice of expression vector. J Biol Chem,1995; 270: 29976-29982  6 Husza′r T, Mucsi I, Terebessy T, et al. The use of a second reporter plasmid as an internal standard to normalize luciferase activity in transient transfection experiments may lead to a systematic error. 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