FLT3基因突变与IL3受体α在急性髓系白血病的表达意义

作者：吴勇, 陈景龙, 骆社丹, 陈元仲   

作者单位：福建医科大学附属协和医院血液科,福州 350001;

【摘要】  目的 研究FLT3 基因突变与IL3受体α(IL3Rα)在急性髓性细胞白血病(AML)的表达及临床意义。 方法 采用RTPCR及限制性片段长度多态性(RFLP)分析检测20 例AML患者IL3Rα的表达水平及FLT3/ITD与D835突变。 结果 20 例中IL3Rα高表达18例,FLT3/ITD 突变7 例,D835突变1 例,总突变率44.4%,对照组未检测到FLT3/ITD 突变。高表达IL3Rα与FLT3/ITD 阳性患者外周血白细胞计数高,白血病细胞比例高,完全缓解率低。 结论 IL3Rα高表达和 FLT3基因突变均赋予急性髓系白血病细胞增殖优势,检测两者水平对于评价AML患者疗效、估计预后具有重要意义。

【关键词】  受体蛋白质酪氨酸激酶； 串联重复序列； 突变； 受体，白细胞介素3； 白血病，粒细胞，急性

　　急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一种涉及多基因遗传学改变的恶性血液病,其特征为细胞分化成熟受阻,未分化细胞大量增殖。目前认为白血病幼稚细胞起源于被称为白血病干细胞(leukemia stem cell,LSC)的细胞,而LSC 则被认为是由相应的正常细胞发生至少两次突变后形成的异常产物。FLT3基因(FMS样酪氨酸激酶3,FMSlike tyrosine kinase3)是Ⅲ型酪氨酸激酶家族成员的原癌基因,FLT3基因突变是AML最常见的基因突变,主要包括内部串联重复突变(internal tandem duplication,ITD)和D835突变。IL3受体是造血细胞因子受体超家族成员之一,IL3受体α亚基(IL3Rα,又叫CD123)是白血病干细胞的特异性标志,其蛋白表达产物CD123在LSC中高度表达,而在正常的造血干细胞中不表达或表达很低[1]。本研究旨在探讨两者与急性髓系白血病的疗效和预后的关系。

　　1  材料与方法

　　1.1  临床资料

　　1.1.1  标本采集和单个核细胞(MNC)的制备  收集福建医科大学附属协和医院血液科2005年3月－2006年6月住院的20例急性髓系白血病患者外周血,年龄中位数35岁(32±3岁)。根据FAB形态学分型,20例患者包括急性原粒细胞白血病未分化型(M1)3例,急性原粒细胞白血病部分分化型(M2)7例,急性早幼粒细胞白血病(M 3)4例,急性单核细胞白血病(M5)6例,外周血幼稚细胞均＞60%,用淋巴细胞分离液密度梯度离心分离外周血单个核细胞(MNC),用PBS液洗涤细胞2遍,-80 ℃保存备用。同时采集4例正常人外周血单个核细胞为对照。

　　1.1.2  仪器与试剂  Trizol试剂(美国GIBCOL公司),反转录试剂盒(Omniscript RT kit,德国Qiagen公司),PCR试剂盒(HotStar Taq  Master mix kit,德国Qiagen公司),限制性内切酶EcoR V(美国 New England Biolabs公司),琼脂糖(美国AMRESCO 公司)。

　　1.2  细胞总RNA提取及cDNA合成  用Trizol试剂提取细胞总RNA,在紫外分光光度计上读取总RNA的260 nm、280 nm吸光度值(D),要求D260/D280>1.8。用反转录试剂盒将上述样本的总RNA反转录成cDNA,逆转录反应体系20 μL,包括细胞总RNA 1 μg,10×逆转录反应缓冲液2 μL,5 mmol/L dNTPs 2 μL,10 μmol/L oligo dT20引物2 μL,10 U/μL RNA酶抑制剂 1 μL,4 U/μL反转录酶1 μL,余用无核酸酶水补至20 μL。在37℃中反应60 min,95℃反应5 min灭活逆转录酶,-20℃保存备用。

　　1.3  RTPCR扩增IL3Rα mRNA的表达水平和FLT3ITD突变  PCR采用HotStar PCR试剂盒,PCR反应体系25 μL：Hotstar Taq Master mix 12.5 μL,cDNA 1.5 μL,10 pmol/μL上、下游引物各0.2 μL,余用水补至25 μL。 PCR反应条件：95 ℃预变性15 min,然后进入循环（94 ℃ 变性30 s→54 ℃或61 ℃退火45 s→72 ℃ 延伸60 s)共30循环,72℃延伸10 min。PCR所用的引物及PCR产物的预期片段为：

IL3Rα：    　　上游：5‘CTGTCTCCTGCAAACGAAGG3’    　　下游：5‘GTTGACGCCTGTTGGCAACG3’

　　预期片段479 bp。

　　FLT3/ITD：    　　上游：5‘GGTGGTTGTCTCCTCTTCATTGTCG3’    　　下游：5‘TTTGACGGCAACCTGGATTG3’

　　预期片段288 bp,包含近膜(JM)区和激酶结构域的起始部位,覆盖文献报道的大多数ITD所在的区域。

　　内参照人βactin：    　　上游：5‘CCTCGCCTTTGCCGATCC3’    　　下游：5‘GGATCTTCATGAGGTAGTCAGTC3’

　　PCR产物的预期片段626 bp。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析结果。

　　1.4  RTPCR限制性片段长度多态性分析FLT3的D835突变  FLT3氨基酸 的D835突变,是由于mRNA 2505突变 A→G,即GATATC→GATGTC,后者不能被EcoR V消化。为了检测FLT3的D835突变,设计一条下游引物5‘CCATCCACATTCTGATACATCGC3’,上游引物同上,PCR反应体系和条件同上,引物退火温度56℃,PCR产物的预期片段1 235 bp,覆盖了文献报道的D835突变点。野生型FLT3 RTPCR 产物用EcoR V消化后产生860 bp和375 bp片段,而突变型的FLT3 RTPCR 产物由于不能被EcoR V消化仍为1 235 bp片段。酶切反应体系20 μL,包括PCR产物10 μL,10×反应缓冲液2 μL,10 U/μL EcoR V 1 μL,余用无核酸酶水补至20 μL。在37 ℃中反应60 min,酶切产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析结果。

　　2  结果

　　2.1  IL3Rα mRNA的表达水平  RTPCR检测发现20例AML患者中18例IL3Rα mRNA的表达水平明显高于正常(图1)。福建医科大学学报  2008年5月  第42卷第3期吴  勇等：FLT3基因突变与IL3受体α在急性髓系白血病的表达意义

　　2.2  FLT3 /ITD突变  RTPCR检测发现20例AML患者细胞FLT3 mRNA的表达水平均高于正常。FLT3/ITD阳性7例,突变率为35%,其中M1 2例,M2 2例,M3 1例,M5 2例。7例中有2例为纯合子突变,5例为杂合子突变。4例对照组样本未检测到FLT3/ITD突变。琼脂糖凝胶电泳显示,RTPCR扩增产物正常在288 bp处出现特异性条带,杂合子突变除上述条带外,还出现一条或多条＞288 bp的特异性条带。纯合子突变则只出现＞288 bp的条带(图2)。  

　　M: PCR Marker (NEB); 14: 患者样本;5,6:正常人.  A: βactin;  B:IL3Rα.

　　图1  RTPCR检测IL3Rα在急性髓系白血病的表达（略）

　　Fig 1  IL3Rα mRNA expression in AML by RTPCR

　　M:123 bp ladder Marker; 111:患者样本; 12:正常人; 6,7,8道:FLT3/ITD阳性; 15,911道:野生型FLT3；12道:FLT3阴性.

　　图2  RTPCR 检测FLT3/ITD在急性髓系白血病的表达（略）

　　Fig 2  FLT3/ITD mutation in AML by RTPCR

　　2.3  FLT3的D835突变  RTPCR限制性片段长度多态性分析发现大部分患者RTPCR产物酶切后产生860 bp和375 bp片段,只有1例患者除出现上述条带外,还出现1235 bp的特异性条带,为FLT3的D835杂合突变(图3)。

　　M: HyperLadder I Marker (BIOLINE); 1,3,5,7,9,11:患者样本RTPCR产物; 2,4,6,8,10,12:相应的EcoR V酶切产物; 10:FLT3/D835突变.

　　图3  RTPCR限制性片段长度多态分析急性髓系白血病细胞FLT3/D835突变（略）

　　Fig 3  FLT3/D835 mutation in AML by RTPCR and RFLP

　　2.4  IL3Rα高表达与FLT3基因突变的关系  在18例IL3Rα高表达AML患者中7例发生FLT3/ITD突变,1例发生D835突变,总突变率44.4 %。

　　2.5  AML患者的临床特征  18例IL3Rα高表达AML患者的白细胞计数的中位数为56.8×109 L-1,外周血幼稚细胞的比例为(81.2±12.3)%,2例IL3Rα低表达AML患者的白细胞计数的中位数为6.8×109 L-1,外周血幼稚细胞的比例为(62.0±1.4 )%。IL3Rα高表达AML患者的白细胞计数显著高于IL3Rα低表达患者。FLT3基因突变AML患者的白细胞计数的中位数为64.4×109 L-1,外周血幼稚细胞的比例为(86.3±12.6)%,FLT3基因未突变的AML患者的白细胞计数的中位数为47.1×109L-1,外周血幼稚细胞的比例为(78.0±11.5)%。

2.6  IL3Rα高表达和FLT3基因突变与疗效预后的关系  20例AML患者均接受治疗,其中4例M3患者接受1月以上维甲酸或砷剂治疗,16例非M3患者接受2个疗程以上的联合化疗。4例M3患者IL3Rα均高表达,3例获得完全缓解,1例FLT3/ITD未获得完全缓解。在16例非M3患者中,7例FLT3基因突变同时IL3Rα高表达的患者只有2例(28.5 %)获得完全缓解,但在6月即复发。其余9例无FLT3基因突变的患者中7例IL3Rα高表达,4例(44.4 %)获得完全缓解,2例IL3Rα高表达在6月内复发。

　　3  讨论    　　IL3是造血干细胞早期多向集落刺激因子,能够促进多能造血干细胞增殖及向髓样干细胞和髓系各前体祖细胞分化,细胞分化成熟后,逐渐对IL3失去反应,成熟细胞后期的增殖与分化有赖于其它细胞因子的作用。人的IL3受体由α亚基(hIL3Rα)和β共同亚基(hβc)组成。体外实验表明，IL3Rα高表达可以提高细胞对IL3 的敏感性,有利于形成为IL3 非依赖性的克隆或在很低剂量的IL3刺激下即能增殖,提示IL3Rα的高表达促进造血细胞过度增殖,有可能导致白血病[2]。国外学者采用流式细胞术比较造血系统恶性肿瘤和正常造血细胞IL3Rα的表达水平,发现绝大部分急性髓系白血病和B细胞急性淋巴细胞白血病以及毛细胞白血病高表达IL3Rα,其表达水平高于正常细胞,而T淋巴细胞白血病和淋巴瘤则很少表达IL3Rα[3]。临床研究表明高表达IL3Rα与AML高白细胞、高原始细胞和预后差有关[4]。本研究检测结果也发现IL3Rα高表达的AML患者临床完全缓解率低,复发率高。    　　已知IL3Rα高表达促进急性髓系白血病细胞的增殖作用与STAT5 活性有关。近来研究发现,FLT3突变也可以激活STAT5途径。当配体与FLT3的细胞外结构域结合时,FLT3二聚体化,其激酶结构域的活化环(activation loop,Aloop)构象发生改变,酪氨酸残基磷酸化,通过多种细胞质蛋白介导细胞内信号传导,调节细胞的增殖与分化。FLT3基因突变破坏正常造血细胞的增殖、分化与凋亡,导致白血病发生[5]。FLT3/ITD突变是目前发现与急性髓系白血病发生与预后相关的最常见的突变类型。国外文献报道大约30%～35%的成人AML存在FLT3/ITD突变,FLT3/ITD突变导致FLT3非配体依赖性磷酸化,异常激活Ras和STAT5途径,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡。此外激酶结构域(TDK)的点突变也可导致FLT3的自身磷酸化及激活下游STAT5途径,使细胞发生非配体依赖性的增殖[6]。一些临床研究表明FLT3突变与AML高白细胞、高原始细胞和预后差有关[7]。本研究检测AML患者FLT3/ITD突变率为35%。与国内外文献报道一致[7]。但FLT3突变组与FLT3未突变组均表现为高白细胞、高原始细胞,原因是两组患者IL3Rα均高表达,临床完全缓解率低,而且IL3Rα高表达伴FLT3突变比不伴有FLT3突变患者完全缓解率更低,复发率高。提示IL3Rα高表达可能与FLT3突变有协同作用,在急性髓系白血病的发生、发展中起重要作用,虽然具体机制目前尚不清楚,但已经明确两者都可通过激活STAT5途径促进白血病细胞增殖。最近FLT3/ITD突变活化STAT5途径的机制得到进一步阐明,FLT3/ITD诱导STAT5活化不依赖Jak激酶,后者的抑制剂SOCS1能够抑制IL3受体信号,但不抑制FLT3/ITD诱导STAT5的活化[8]。    　　笔者认为，IL3Rα高表达与FLT3基因突变赋予急性髓系白血病细胞生存优势,导致急性髓系白血病细胞耐药与复发。若能早期预测难治或复发,采用更适宜的治疗方案有利改善预后。临床上可将IL3Rα的表达水平与FLT3基因突变作为早期判断预后的指标,也可用于急性髓系白血病缓解后微小残留病的检测。同时,国际上业已开展以IL3Rα与FLT3基因作为靶点的靶向基因治疗临床研究[910]。这些研究都将进一步提高急性髓系白血病患者的存活率。

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