核转录因子-κB抑制剂对儿童急性淋巴细胞白血病细胞生长调控和凋亡的影响及意义

作者：安琪，薛天阳，许 伟，高吉照    作者单位：1.徐州市儿童医院，江苏徐州；2.徐州医学院附属医院儿科，江苏徐州

【摘要】  目的 探讨核转录因子-κB(NF-κB)抑制剂对儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞生长和凋亡的影响及意义。方法 分组：对照组、对甲苯磺酰-L-苯丙氨酸甲基甲酮(TPCK)组、地塞米松（Dex）组、TPCK+Dex组。MTT比色分析法测定细胞生长抑制率，流式细胞术测定细胞凋亡率。结果 TPCK和Dex均可引起ALL细胞生长抑制和凋亡，其生长抑制率和凋亡率与对照组比较，差异均有统计学意义（P均＜0.01）。TPCK+Dex组的生长抑制率和凋亡率显著高于两者单独使用时，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。结论 NF-κB可能通过抑制细胞凋亡和促进细胞增殖参与儿童ALL的发病。抑制NF-κB信号传导途径可能在儿童ALL治疗中有重大价值。

【关键词】  急性淋巴细胞白血病；核转录因子-κB抑制剂；细胞增殖；细胞凋亡

 The effect and significance of nuclear  factor-κB protease inhibitor on cell

    proliferation and apoptosis in childhood acute lymphoblastic leukemia

    AN Qi1, XUE Tianyang2*, XU Wei2, GAO Jizhao2

    (1. Xuzhou Children's Hospital, Xuzhou, Jiangsu 221006, China; 2. Department of Pediatrics,

    Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou, Jiangsu 221002）

    Abstract: Objective  To investigate the effect and significance of nuclear factor-κB protease inhibitor on cell proliferation and apoptosis in childhood acute lymphoblastic leukemia (ALL). Methods  The ALL cells were divided into four groups: control group, p-Tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK) group, dexamethasone (Dex) group, cotreatment (TPCK and Dex) group. MTT colorimetric assay was employed to determine the cell proliferation and flow cytometry was utilized to investigate the apoptosis of ALL cells. Results  Both TPCK and Dex could induce ALL cells apoptosis and their differences in growth inhibition rate and apoptosis rate between those of control group were considered statistically significant (P<0.01). Conclusion  NF-κB may be involved in childhood ALL progression by prohibiting cell apoptosis and promoting cell proliferation. The inhibition of NF-κB conduction pathway may has significant value in childhood ALL treatment.

    Key words: acute lymphoblastic leukemia; nuclear  factor-κB protease inhibitor; proliferation; apoptosis

    近年来，研究发现核转录因子-κB（NF-κB）在肿瘤的发生、发展中起重要作用，它可调控细胞的增殖、分化、凋亡与恶性转化［1］。本实验采用MTT比色分析法和流式细胞术测定急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞的生长率和凋亡率，以探讨NF-κB抑制剂对儿童ALL细胞的生长和凋亡的影响及意义。

    1  资料和方法

    1.1  一般资料  选择2003年1月—2005年1月的ALL住院患儿20例，其中男15例，女5例；年龄1岁6个月～13岁，中位年龄6岁。诊断标准均按照1999年“小儿急性淋巴细胞白血病诊疗建议”［2］。

    1.2  方法

    1.2.1  标本  取患儿化疗前骨髓2 ml，分离单个核细胞，制备106/ml细胞悬液，取50 μl细胞悬液滴片，冷丙酮固定，用SP免疫组化法检测NF-κB p65蛋白表达率(按试剂盒说明书进行) 。选取NF-κB p65蛋白表达阳性的细胞悬液。

    1.2.2  分组  对照组，细胞悬液作为对照组；对甲苯磺酰-L-苯丙氨酸甲基甲酮组(TPCK组) ，终浓度为40 μmol/L，培养2 h；地塞米松组（Dex组），终浓度5.0 μg/ml，培养24 h；TPCK联合Dex组（TPCK+Dex组），先以40 μmol/L TPCK培养2 h，撤药， 再加入5.0 μg/ml Dex培养24 h。每组设3个复孔。

    1.2.3  MTT比色分析  培养至既定的时间，各组细胞经1800 r/min离心5 min，弃上清，悬浮于200 μl/孔的MTT(5 mg/ml)中，继续孵育4 h。离心弃上清，加二甲基亚砜（DMSO），200 μl /孔轻振荡，酶联免疫检测仪测定570 nm D值 。生长抑制率=〔(对照组D值-实验组D值)/对照组D值〕×100%。

    1.2.4  流式细胞术分析  收集处理的各组细胞106个，用PBS洗涤后，70%乙醇4℃固定，过夜，再用PBS洗涤2次。加1 ml碘化丙啶（PI），4℃避光，孵育30 min，流式细胞仪检测凋亡率。1.3  统计学处理  应用SPSS 10.0统计软件对数据分析，实验结果采用单因素方差分析。多个实验组与对照组比较采用最小显著差法（LSD），多个实验组之间的比较用q检验。

    2  结  果

    2.1  TPCK和Dex对儿童ALL细胞生长调控的规律  生长抑制率和凋亡率：与对照组比较，各组差异均有统计学意义（P均＜0.01）；Dex组与TPCK组相比较，差异亦有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。 TPCK+Dex组的生长抑制率和凋亡率显著高于两者单独使用时（P＜0.05或P＜0.01），见表1。各组在流式细胞仪图谱中均可见到亚G1峰的出现，其细胞凋亡率见图1。表1  TPCK及Dex对ALL细胞的生长抑制率和凋亡率的影响

　　3  讨  论

    目前认为，NF-κB可能通过上调促细胞存活基因表达，或抑制促凋亡基因，或活化持续性正性生长信号，从而保护细胞免于凋亡［3-4］。如何在病理状态下抑制NF-κB的活性，从而达到治疗肿瘤的目的，已成为目前研究的的热点。NF-κB已成为治疗肿瘤的一个理想的靶分子［5］。

    TPCK是胰凝乳蛋白酶类似的丝氨酸蛋白水解酶抑制剂，能抑制IκB磷酸化的水解，从而抑制NF-κB的活化，是研究NF-κB活化作用的理想抑制物［6］。国内许多学者研究证实，TPCK可以特异性地抑制NF-κB的激活［7-8］。一些文献报道Dex也是NF-κB的非特异性抑制剂［9-10］。有关NF-κB抑制剂对儿童ALL细胞的影响国内外鲜有报道。我们选择TPCK和Dex 两种NF-κB活化抑制剂，在体外观察它们对ALL细胞增殖和凋亡的影响，以寻求治疗ALL的新方法。

    实验中我们选择40 μmol/L TPCK培养2 h及5.0 μg/ml Dex作用24 h，因为在此两种条件下ALL细胞中NF-κB p65蛋白均转为阴性表达［11］。结果显示TPCK和Dex能抑制ALL细胞生长及促进其凋亡，两者联合作用更强。提示TPCK和Dex作为NF-κB抑制剂，能有效抑制NF-κB的活化，进一步证实了NF-κB可能通过保护细胞生存和抑制凋亡机制而参与儿童ALL的发病。

    NF-κB主要通过以下途径发挥抗凋亡作用：①诱导或上调抗凋亡基因抑制凋亡。NF-κB能激活Bcl-2家族中抗凋亡蛋白A1/Bf-1而抑制由TNF-α引起的细胞凋亡［12］。②诱导TNF受体结合因子(TRNF)和凋亡抑制因子(IAP)从而抑制细胞凋亡。③通过调控细胞因子而参与自身及其他细胞的凋亡。目前较为肯定的抑制细胞凋亡的细胞因子如TNF-α、IL-6、IL-8 、IL-1β、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等均受NF-κB的调控［13-14］。

    实验中我们发现Dex对细胞的生长抑制率和凋亡率均高于 TPCK的作用。提示Dex除有抑制NF-κB活性作用外，还有其他途径。研究发现，糖皮质激素（GC）主要通过糖皮质激素受体（GR）发挥对ALL细胞的作用［15］。GC作为一种磷脂类物质，易于通过细胞膜进入细胞，于胞质内普遍存在的GR结合，继而类固醇－受体复合物易位进入细胞核，在细胞核内与糖皮质激素反应元件（glucorticoid response element，GRE）结合，作为转录因子而发挥作用。Tao等［16］研究认为，GC的功能部分通过GR发挥作用，部分通过对NF-κB的超抑制发挥作用。因而抑制NF-κB的活性只是Dex的作用机制之一。

    综上所述，抑制NF-κB信号传导途径可能在儿童ALL治疗中有重大价值。NF-κB抑制剂联合化疗药物是治疗肿瘤的一个理想的举措。

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