血红蛋白A2单克隆抗体的制备与鉴定

作者：陈志成，杨金菊，刘蓉，曲海霞，王婉，刘莉，柳晓兰，陈勇 刘莹，高建恩，孙启鸿    作者单位：军事医学科学院放射与辐射医学研究所免疫学研究室，北京 100850

【摘要】  本研究目的是制备鼠抗人血红蛋白A2（HBA2）单克隆抗体（McAb）并进行初步鉴定。将正常人胎肝组织匀浆离心并分离出人胎肝核总蛋白, 用人胎肝核总蛋白免疫BALB/c 小鼠, 采用杂交瘤技术制备单克隆抗体, 并通过间接ELISA法、Western blot及免疫组织化学的方法对单克隆抗体进行特异性鉴定, 通过免疫沉淀和UniZAP XR表达文库筛选鉴定抗原。结果表明： 通过间接ELISA筛选获得分泌AEE091抗体的杂交瘤细胞1株，其分泌的单克隆抗体Ig亚类（型）为IgG1 (κ)； Western blot 结果显示，该抗体识别分子量为15 kD的蛋白； Western blot识别AEE091免疫沉淀获得的分子量为15 kD的抗原；同时应用单克隆抗体AEE091对人肝脏cDNA表达文库（UniZAP XR）进行筛选，筛选所获得的阳性噬菌斑测序结果显示两个阳性克隆插入序列均为HBA2。结论: 经筛选获得了分泌AEE091抗体的杂交瘤细胞株。AEE091抗体能特异识别HBA2抗原，因而其在HBA2的功能研究和珠蛋白生成障碍性贫血筛查等方面具有应用价值。

【关键词】  地中海贫血

      Preparation and Identification of Monoclonal Antibody against Homo Sapiens Hemoglobin alpha 2 (HBA2)

    CHEN ZhiCheng1, YANG JinJu2, LIU Rong1, QU HaiXia2, WANG Wan2,

    LIU Li1, LIU XiaoLan1, 2，CHEN Yong1, 2, LIU Ying2, GAO JianEn1, 2, SUN QiHong1, 2

    1Department of Immunology,  Institute of Radiation Medicine,  Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China; 2Department of Antibody Engineering, Beijing Proteome Research Center, Beijing 102206, China

    Abstract    This study was purposed to prepare and identify monoclonal antibodies (McAbs) against Homo sapiens hemoglobin alpha 2 (HBA2). Normal human fetal liver tissues were homogenized, and human liver nuclear proteins were isolated by centrifugation. The total human fetal liver nuclear proteins were used to immunize BALB/c mice for preparing McAbs by hybridoma technique. The McAbs specificity was  identified  by ELISA, Western blot, and immunohistochemistry. The antigen was identified by UniZAP expression library screening.  The results showed that one hybridoma cell line, AEE091, secreting specific McAb against HBA2 was established. The Ig subclass of this McAb was IgG1 (κ). Data from immunohistochemistry assay  showed that AEE091 could recognize human liver nuclear protein. Using AEE091 McAb, isolation of  the protein antigen by IP  revealed  that AEE091 McAb could recognize 15 kD protein.  Screening the    UniZAP XR premade liver cDNA library  with AEE091 hybridoma cell supernatants demonstrated that AEE091 McAb specially reacted with HBA2. It is concluded that a hybridoma cell line stably secreting specific McAb against HBA2 is established. The specific McAb against HBA2 would be very useful for studying HBA2 function and screening thalassanemia.

    Key words    Homo sapiens hemoglobin alpha 2; McAb; cDNA expression library; thalassanemia

    J Exp Hematol 2007; 15(4):823-826

    血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质。人体内的血红蛋白由4个亚基构成，分别为2个α亚基和2个β亚基，血红蛋白的每个亚基由1条肽链和1个血红素分子构成，肽链在生理条件下会盘绕折叠成球形，把血红素分子包在里面，这条肽链盘绕成的球形结构又被称为珠蛋白。珠蛋白生成障碍性贫血(又称地中海贫血)是由于珠蛋白基因组织的多种突变或缺失，致使珠蛋白合成障碍，正常血红蛋白不能形成，使红细胞易被破坏，寿命缩短。珠蛋白生成障碍性贫血是一种对人类健康危害较大的遗传性疾病，在我国南方较为常见。正常成人红细胞所含主要血红蛋白A(α2β2)由2条α珠蛋白链和2条β珠蛋白链组成，其余2%-3％是血红蛋白A2(α2δ2)，2％以下是血红蛋白F(α2γ2)。珠蛋白生成障碍性贫血的基因突变是异质、多态性的，加之纯合子、杂合子的差异，因而有非常不同的表现型。基因完全缺失或基因突变使1种或2种珠蛋白完全不能合成者，称为α、β或(αβ) 珠蛋白生成障碍性贫血；尚能部分合成者，称为α+、β+或(αβ)+珠蛋白生成障碍性贫血［1，2］。重型β珠蛋白生成障碍性贫血的HbA2通常减低，也有正常或升高的。轻型β珠蛋白生成障碍性贫血（A2型）的HbA2都轻度增高，HbA2的轻度增高是轻型β珠蛋白生成障碍性贫血的唯一阳性发现。传统的HBA2定量需经过HB电泳，计算，需要较长的时间且步骤繁琐［3，4］。因此，制备的HBA2单克隆抗体，可能为珠蛋白生成障碍性贫血的诊断提供一个快速，经济和准确的方法。

    材料

    免疫和筛选用胎肝核总蛋白，由本室制备。其它主要试剂和仪器包括：弗氏佐剂（Sigma公司产品），羊抗鼠IgGHRP（中山公司产品），蛋白酶抑制剂（Roche公司产品），BCA蛋白定量试剂盒（Pierce公司产品），PVDF膜（Amersham公司产品），ECL反应试剂盒（Amersham公司产品），DY89Ⅱ型电动玻璃匀浆机（宁波新芝生物科技股份有限公司产品）。

    胎肝核总蛋白抗原的制备

    胎肝组织以每分钟700-750转制成匀浆，10克胎肝组织加40 ml匀浆缓冲液，以70900×g蔗糖密度梯度离心90分钟，离心后取沉淀物，获得胎肝核总蛋白，应用BCA法测定蛋白浓度。

    鼠抗人单克隆抗体的制备

    将胎肝核总蛋白1 mg与等体积弗氏完全佐剂混合后进行充分乳化，给小鼠多点皮下注射。首次免疫后4周加强免疫1次，1周后经尾静脉取血，分离血清，ELISA法测定效价。融合前3天进行加强免疫，取免疫小鼠的脾细胞与X653细胞进行细胞融合，采用杂交瘤技术制备单克隆抗体。

    抗原的鉴定

    免疫沉淀鉴定抗原  应用单克隆抗体从胎肝核总蛋白中免疫沉淀得到相应的抗原，并进行SDSPAGE电泳和Western blot分析。

    筛选UniZAP XR人肝脏cDNA表达文库鉴定抗原取大肠杆菌XL1BLUE MRF'过夜培养菌接种于LB培养液中，37℃震荡培养至OD600为0.7左右， 300×g离心10分钟，用10 mmol/L的硫酸镁重悬细菌沉淀至OD600为0.5，取适当稀释的文库60 μl（含约50000个噬菌体）与600 μl重悬的XL1BLUE MRF'混匀后37℃温育20分钟，铺至150 mm的NZYLB平板上，42℃倒置培养至噬菌斑模糊可见，将浸泡过IPTG的NC膜覆盖表面，37℃继续培养3.5小时，用防水墨水定位后，剥离滤膜，进行常规Dot blot检测。在原位板上回收阳性克隆，用ExAssist辅助噬菌体进行体内剪切、测序及Western blot分析。

    AEE091 单克隆抗体的鉴定

    Western blot 分析  胎肝核总蛋白经SDSPAGE后，电转至PVDF膜上。用50 g/L脱脂奶粉室温下封闭1小时，然后加入AEE091杂交瘤细胞培养上清，室温下孵育2小时，用TBST缓冲液洗膜后，加入羊抗鼠IgGHRP抗体（1∶5 000稀释），室温下孵育1小时，TBST缓冲液洗膜后，用ECL法显色。

    免疫组织化学鉴定  用丙酮固定的冰冻胎肝组织切片，用PBST浸洗5分钟后每个组织片滴加25 mg/L的亲合素（avidin) 50 μl，室温孵育15分钟，滴加3%  H2O2甲醇，室温孵育15分钟。滴加正常羊血清室温下封闭30分钟，加入杂交瘤AEE091的培养上清液，4℃孵育过夜。用PBS洗片后加入羊抗鼠IgGHRP，37℃孵育30分钟，用PBS洗片后进行DAB显色，苏木素复染，返蓝后封片。

    结    果

    胎肝核总蛋白抗原

    胎肝组织匀浆经70900×g蔗糖密度梯度离心沉淀，获得了胎肝核总蛋白 80 mg。

    鼠抗人单克隆抗体

    应用细胞融合、ELISA间接筛选和克隆化，获得了鼠抗人胎肝核总蛋白阳性抗体AEE091，其亚类（型）为IgG1(κ)。

    抗原的鉴定

    Western blot和免疫沉淀鉴定  Western blot 结果表明，AEE091 McAb识别该分子量为15 kD的蛋白（图1）。应用AEE091   McAb从胎肝核总蛋白中免疫沉淀，得到相应的抗原，经SDSPAGE电泳和Western blot 分析表明，AEE091 McAb免疫沉淀得到了分子量为15 kD的蛋白。

     筛选UniZAP XR人肝脏cDNA表达文库鉴定抗原  用获得的AEE091的细胞培养上清对人肝脏cDNA表达文库进行第一轮的筛选，得到了阳性噬菌斑4个（图2 A）。取阳性噬菌斑进行第2轮筛选，得到了单克隆的阳性噬菌斑10个（图2 B）。分离2个独立的阳性克隆进行体内剪切并转化入大肠杆菌中，将得到的阳性克隆进行诱导表达，菌体蛋白经Western blot鉴定，AEE091 McAb能识别分子量为15 kD的表达蛋白。测序结果表明，阳性克隆插入基因起始位置为HBA2的前导肽，距起始密码子ATG10bp（图3）。因此，阳性克隆的AEE091识

    别的蛋白为HBA2，并推定阳性克隆中插入的基因为HBA2的全长。

    AEE091单克隆抗体的免疫组织化学鉴定

    免疫组织化学结果显示，鼠抗人HBA2 单克隆抗体AEE091识别的抗原主要定位于胎肝细胞核中（图4）。

    讨    论

    本研究在制备抗HBA2单克隆抗体中并没有采用将已知抗原HBA2免疫动物获得相应单克隆抗体这样的传统路线，而是采用通过胎肝核总蛋白混合免疫小鼠，得到多株单克隆抗体，然后将这些抗体进行进一步的鉴定，筛选人肝脏cDNA表达文库，确定其相应抗原的方法，成功地制备出了抗HBA2的单克隆抗体。因为免疫所用的抗原是天然的蛋白，通过这种方法制备的抗体具有识别天然蛋白的特征，有利于抗体的进一步应用。采用该方法制备抗体效率高，可以在短时间内制备大量的针对不同抗原的单克隆抗体，通过Western blot分析单克隆抗体AEE091，表明其具有很好的特异性。应用该抗体进行免疫沉淀，可以得到相应的抗原，该抗原正是免疫所用的天然蛋白抗原。应用单克隆抗体AEE091对人肝脏cDNA表达文库进行筛选，所获得的2个阳性克隆经过测序，比对，最终鉴定AEE091所识别的抗原为HBA2。免疫组织化学检测结果显示，单克隆抗体AEE091识别的抗原HBA2定位于胎肝脏细胞核中。岳秀玲等［5］应用抗血红蛋白的抗体检测尿中血红蛋白，结果显示单克隆抗体检测疾病具有灵敏度高，特异性好的特点，因此所制备的抗HBA2抗体AEE091将成为研究HBA2的有利工具。

【参考文献】1赵永忠，徐湘民，徐钤. 非缺失型α地中海贫血的分子基础. 中华医学遗传学杂志，1996； 13: 292-293

2叶应妩，王毓三主编. 全国临床检验操作规程. 第二版. 南京：东南大学出版社. 1997: 58-61

3Kalleas C, Tentes I, Margaritis D, et al. Effect of HbS in the determination of HbA(2) with the TOSOH HLC723G7 analyzer and the HELENA BetaThal Quik column kit. Clin Biochem, 2007; 40: 242-247

4Ayala S, Colomer D, Pujades A, et al. Haemoglobin Lleida: a new alpha 2globin variant (12 bp deletion) with mild thalassaemic phenotype. Br J Haematol, 1996; 94: 639-644

5岳秀玲，周建山，丛玉隆. 单克隆抗人血红蛋白抗体法检测尿中血红蛋白. 临床检验杂志,1997; 15: 319［］μβαγ ±SD