特发性血小板减少性紫癜患者激素敏感性与糖皮质激素受体亚型的关系研究

作者：朱琦,程毅敏,叶为德,胡钧培*    作者单位：上海交通大学医学院附属第九人民医院血液科,上海 200011

【摘要】  目的 探究特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者对糖皮质激素敏感性与其外周血单个核细胞内激素受体亚型表达的关系。方法 采用实时定量RTPCR和免疫组化技术检测不同激素敏感性ITP患者（包括糖皮质激素抵抗和敏感病人）外周血单个核细胞内α和β亚型糖皮质激素受体（GRα和GRβ）mRNA和蛋白表达，并将检测结果与正常对照组进行比较。结果 糖皮质激素抵抗组患者外周血单个核细胞GRβ mRNA表达量和GRβ蛋白表达阳性的单个核细胞比率明显高于激素敏感组及正常对照组(P<0.01)，而GRα mRNA和蛋白表达水平，各组之间无显著差异。结论 ITP患者糖皮质激素敏感性与其GRβ表达水平密切相关。

【关键词】  特发性血小板减少性紫癜； 糖皮质激素； 糖皮质激素受体亚型； 激素敏感性

　　1 资料与方法

    1.1 病例选择 40例ITP患者均为我院血液科住院患者，全部病例均经临床和实验室检查，符合ITP诊断标准[3]。40例ITP患者按其对糖皮质激素治疗的反应性分为2组，激素敏感组（强的松足量治疗6周，治疗剂量1.0 mg/kg·d-1，血小板计数≥50×109/L）23例，其中男性8例、女性15例，平均年龄53岁（36~68岁），治疗前血小板平均计数25×109/L（10～37×109/L）；激素抵抗组（强的松足量治疗6周，治疗剂量1.0 mg/kg·d-1，血小板计数＜50×109/L17例，其中男性6例，女性11例，平均年龄52岁（38~70岁），治疗前血小板平均计数24×109/L（11～38×109/L）。两组患者年龄、性别构成、治疗前血小板平均计数，经统计学检验差异无显著性（P>0.05）。另外选择20例健康志愿者作为正常对照组，其中男性8例，女性12例，平均年龄54岁（37~69岁），均系我院职工，经临床和实验室检查后排除ITP等血液疾病，在检测前2周，无感染性疾病，并未服用过糖皮质激素或其它免疫抑制剂。

    1.2 标本采集和PBMC分离 空腹抽取ITP患者和健康志愿者外周静脉血10 ml（EDTA抗凝），应用淋巴细胞分离液，按照文献报道[4]的方法，分离收集PBMC待检。

    1.3 实时定量RTPCR检测PBMC内GRα和GRβ的mRNA表达 引物设计：GRα，GRβ和内参照管家基因βactin的特异性引物由英骏生物技术有限公司（Invitrogen Biotechnology Co. Ltd）合成，GRα和GRβ的共用上游引物为：5’ CAA AAC TCT TGG ATT CTA TGC ATG AA 3’；GRα的下游引物为：5’ TTG GAA GCA ATA GTT AAG GAG ATT TTC 3’；GRβ的下游引物为：5’ ATT AAT GTG TGA GAT GTG CTT TCT GG 3’；扩增产物分别为59 bp和70 bp。管家基因βactin的上游引物为：5’CTG GCA CCC AGC ACA ATG  3’，下游引物为：5’CCG ATC CAC ACG GAG TAC TTG  3’，产物大小为68 bp。RNA抽提和逆转录反应：采用RNA抽提和逆转录试剂盒RNeasy Protect Midi Kit及QIAGEN Sensiscript RT Kit，按照试剂盒说明书操作从PBMC中抽提RNA，RNA经定量后，逆转录为cDNA保存。实时定量PCR反应：反应体系为：模板cDNA 0.5 μl，上、下游引物各0.15 μl，含荧光探针的反应混合液SYBR Green master mix （购自Applied Biosystems，ABI）5.0 μl，无菌蒸馏水4.2 μl，总反应体积为10 μl。反应条件：PCR扩增前先于50℃孵育2 min，后再于95℃孵育10 min，随后进行PCR循环，包括95℃ 15s，60℃ 60 s，共40个循环。所有PCR反应均使用ABI PRISM 7900实时定量PCR仪（购自Applied Biosystems，ABI），按照其说明书进行操作，数据由该仪器收集并分析。待测目的基因mRNA表达量计算方法：应用Applied Biosystems公司提供的分析软件，以管家基因β－actin作为内参照，待测目的基因相对表达量以2⊿Ct表示，其中⊿Ct是内参照基因和目的基因Ct值的差值。Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。

    1.4 免疫组织细胞化学方法检测 PBMC内GRα和GRβ的蛋白表达 取4×104个PBMC，经磷酸缓冲液清洗，细胞涂片仪离心涂片，过夜自然晾干，采用兔抗人GRα和GRβ 抗体（购自Santa Cruz, CA,USA），按照试剂说明书进行操作，兔抗人GRα和GRβ抗体浓度分别为1∶300、1∶200。最后在光学显微镜下计数每100 个PBMC细胞中的免疫反应阳性细胞数，计算百分比。

    1.5 统计学处理 测定结果采用x±s表示，比较采用t检验，P<0.05表示有统计学意义。

    2 结 果

    2.1 激素敏感型和激素抵抗型ITP患者以及健康志愿者PBMC内GRα和GRβ mRNA表达水平 激素抵抗型ITP患者PBMC内GRβ mRNA表达量明显高于激素敏感型ITP患者及健康志愿者 (P<0.01)，而PBMC内GRα mRNA表达水平，各组之间的差异无统计学意义 (P>0.05)。检测结果见表1。表1 不同组别PBMC内GRα和GRβ mRNA表达的比较组别 例数 GRα mRNA GRβ mRNA激素敏感型ITP 23 10.21±2.12 3.11±0.69激素抵抗型ITP 17 11.12±3.81 8.21±0.61*正常对照组 20 10.13±2.53 2.11±0.33*激素抵抗型ITP与激素敏感型ITP、正常对照组比较P<0.01

    2.2 激素敏感型和激素抵抗型ITP患者以及健康志愿者GRα和GRβ蛋白免疫组化阳性的PBMC比率 激素抵抗型ITP患者GRβ蛋白免疫组化阳性PBMC比率明显增高，与激素敏感型ITP患者及健康志愿者比较，差异有统计学意义(P<0.01)，而GRα蛋白免疫组化阳性PBMC比率，各组之间无显著差异((P>0.05)。检测结果见表2。表2：不同组别GRα和GRβ蛋白免疫组化阳性的PBMC比率

    3 讨 论

　　ITP患者对糖皮质激素耐药的机制较为复杂，由于糖皮质激素的药理效应主要通过靶细胞内GR介导程序化地打开或关闭一系列基因的表达来实现，因此，GR成为研究糖皮质激素抵抗机制的重要切入点。人类GR包括两大亚型GRα和GRβ，虽然两者蛋白结构上只是羧基端不同，但GRα能够与激素结合并激活相应基因转录，而GRβ无激素结合活性以及激活靶基因转录能力，因而，有学者认为，GRβ可能是一种重要的内源性糖皮质激素效应负性调节因子，它的表达量某种程度上决定了靶细胞对糖皮质激素的敏感性[5]。鉴于此，近来有关免疫性疾病糖皮质激素抵抗现象和GRβ关系的研究报道日益增多[6, 7]，但有关ITP患者激素敏感性与GRβ关系的临床研究还较少见。我们检测了40例糖皮质激素敏感和抵抗型ITP患者以及20例健康志愿者PBMC中GRα和GRβ的mRNA表达情况，结果发现ITP患者和正常对照组PBMC内GRα和GRβ mRNA均有表达，其中GRα表达量较高，提示PBMC内具有激素结合和转录激活能力的GRα占主导地位，但各组之间GRα mRNA表达差异无统计学意义，说明强势表达的GRα对PBMC激素敏感性的影响较小。另一方面，我们的检测结果显示激素抵抗型ITP患者PBMC内GRβ mRNA表达量明显高于激素敏感型ITP患者及健康志愿者，说明ITP患者PBMC中GRβ表达量和患者对治疗剂量糖皮质激素敏感性显著相关。免疫组化的检测结果也显示，激素抵抗型ITP患者GRβ阳性PBMC比率明显高于激素敏感组和正常对照组，这些结果进一步提示PBMC中GRβ可能是决定ITP患者激素敏感性重要因素之一。那么相对于高表达的GRα，弱势表达的GRβ如何调控靶细胞对糖皮质激素的敏感性？激素抵抗型ITP患者GRβ为何会增高？部分学者推测，GRβ可能通过显性负抑制GRα的转录激活，负性调节靶细胞对糖皮质激素的敏感性[8]。GRβ表达的异质性是造成激素抵抗型ITP患者GRβ增高的可能原因[5]。但这些观点还有待进一步研究和证实。综上所述，ITP患者糖皮质激素敏感性与其PBMC内GRβ表达水平密切相关。因此，在应用糖皮质激素治疗ITP患者时，尽早对患者PBMC内GRβ表达进行评估，有助于预测患者对激素治疗的反应，为临床上开展ITP患者个体化治疗提供依据。

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