微柱凝胶免疫分析技术在血小板抗体筛选中的应用

作者：许德义，董国飞，张哲，彭明喜，杜勇，陈长水，汤晓娴，付荆艳，高家良，白洁 ，马幼丽 ， 钱伯勇， 马建波    作者单位：宁波市中心血站，宁波 315040

【摘要】  为了探讨微柱凝胶免疫分析技术在血小板输注中血小板抗体筛选和配型的临床应用价值，运用微柱凝胶免疫分析技术检测血小板抗原抗体反应,包括抗体筛检、交叉配血。结果显示： 30例再生障碍性贫血（AA）、11例骨髓增生异常综合征（MDS）和25例白血病患者中24例血小板抗体的检测均为阳性，20例其他病例中有1例血小板抗体检测阳性（占5%），20例正常献血员的血小板抗体检测均为阴性。多次输注血小板的112个AA血液标本、42个MDS血液标本和95个白血病血液标本的血小板抗体交叉相合数分别为45、20和40个，相合率分别为40.18%、47.62%和42.11%； 20例多次输注血小板的病人交叉配合前的血小板增高指数(CCI)平均为4.7，交叉配合后为18.2。结论：恶性血液病患者中血小板抗体筛检的阳性率很高；249个血液标本的血小板交叉配型的相合率在40%-48%之间；交叉配型后的血小板临床使用效果明显提高。

【关键词】  微柱凝胶免疫法

     Application  of  Microcolumn Gel Immunoassay in  Screening  the Platelet  Antibody

    XU DeYi,DONG GuoFei,ZHANG Zhe,PENG MinXi,DU Yong,CHEN ChangShui,

    TANG XiaoXian,FU JingYan,GAO JiaLiang1,BAI Jie2,MA YouLi3,QIAN BoYong4,MA JianBo5

    Ningbo  Blood  Center, Ningbo  315040, China;1Department of Clinical Laboratory Examination, Yinzhou People  Hospital, Ningbo 315040, China; 2Department of Clinical Laboratory Examination, The First People Hospital, Ningbo 315010, China; 3Department of Blood Transfution, Lihuili Hospital, Ningbo 315040, China; 4Department of Clinical Laboratory Examination, The Affiliated Hospital, Medical College of Ningbo University, Ningbo 315020, China; 5Department of Clinical Laboratory Examination, The Second People Hospital, Ningbo 315020,China

    Abstract    The purpose of this  study was to explore the clinical value of the platelet antibody screening  and typing in  platelets transfusion by using  microcolumn gel immunoassay (MGIA). The platelets antigenantibody reactions  including the antibody screen and  blood crossmatch were detected  by MGIA. The  results indicated that the detection of platelet antibody showed positive in 30 cases of aplastic anemia (AA), 11  cases of myelodysplastic  syndrome (MDS),  24 out of  25 cases of leukemia and 1 out of cases of other diseases, while detection of platelet antibody showed negative in  20 normal volunteer donors. The number of platelet antibody crossmatch coincidence in 112 specimens of AA, 42 specimens of MDS and 95 specimens of leukemia were 45, 20 and 40, the  coincidence rates were 40.18%、47.62% and 42.11% .The mean corrected count increment (CCI) in  20 patients  received platelet transfusion many times was 18.2 after crossmatch and 4.7 before crossmatch. It is concluded that the  positive rate of platelet antibody screening  is very high in patients with hematologic malignancies, the  coincidence rate  of platelet antibody crossmatch in   249  blood  samples is  between 40%  and 48%, and the effeciency of using crossmatched platelets in clinic is enhanced significantly.

    Key words    platelet antibody screening; platelet typing; microcolumn gel immunoassay

    J Exp Hematol 2007; 15(4):888-891

    近年来，随着临床输血事业的发展、成分输血的推广，各种血液成分的应用也正在发生变化, 血小板（Plt）的使用日益广泛。然而，病人经多次输注血小板后，会产生各种抗体，容易造成血小板输注无效，因此有必要建立血小板抗体筛选配型技术。现在，临床上如血小板生成障碍、血小板功能异常、稀释性血小板减少的病人均需提供血小板，然而多次输注后， 由于免疫因素或其他因素使输入的血小板破坏，输注效果不佳或完全无效，因而成为临床医生的难题。究其原因——血小板输注无效主要是免疫性破坏，这是当前输血领域内所关注的焦点之一。引起免疫性血小板输注无效的原因首先是HLA抗原不合，其次是血小板特异抗原的抗体，常见的有抗HPA2b等。现在常用的抗体检测方法有血小板单克隆特异性抗体固定试验（MAIPA）、微柱凝胶试验（MGT）、简易致敏红细胞血小板血清学试验（SEPSA）等。

    微柱凝胶免疫分析技术在血小板抗体筛选中的应用大部分免疫性血小板减少性紫癜患者血小板膜上可测出血小板相关抗体（PA ），包括IgG、PA IgM、PA IgA，其中一项出现阳性，即为血小板抗体检测阳性，而且其量往往与外周血的血小板数量呈负相关，因此检测这种血小板相关抗体有助于免疫性血小板减少性紫癜的诊断［1］。

    目前，在宁波市各大医院的临床工作中很需要开展血小板配型的研究，为此我们建立了血小板配型技术，用微柱凝胶方法进行血小板交叉配合试验选择供者，即选择供者血小板与受者血清中已产生的抗体不发生抗原抗体反应的供者。该项目的开展解决了临床上血小板输注无效的难题，提高了临床血小板输注疗效，具有重要的临床意义。

    材料和方法

    病例

    66例血液病患者（包括AA  30例，MDS 11例，白血病25例），其他病例20例，正常献血员20例。检验标本均来自于2004年10月至2006年8月期间宁波市各大医院的病人及随机抽取的来我站献血的正常献血员。

    仪器

    SORVALL  Biofuge  pico 离心机、BYL型血型血清学多用离心机（BYFI型，长春博研科学仪器有限公司）、免疫微柱孵育器。

    试剂

    试剂由中国吉林省长春博迅生物技术责任有限公司提供，试剂盒由微柱凝胶抗人球蛋白试剂卡、指示红细胞、红细胞保存液、对照血清(血小板抗体阴性血清、血小板抗体阳性血清)、裂解血小板、稀释液组成。

    微柱凝胶卡18-25℃避光保存，配置试剂4-8℃避光保存。所有试剂及凝胶卡使用前应达到室温(不低于20℃)，如果温度过低(低于18℃)，则凝胶卡应放在37℃条件下孵育30分钟。

    抗体筛选

    血浆标本制备  应用含促凝剂的试管。采集被检对象静脉血2-5毫升，轻轻摇动混匀2分钟， 1 000-1 200×g离心5分钟，取上清。

    血清标本制备  采集被检对象静脉血，放入无抗凝试管中，4℃放置12小时，或37℃放置2小时后1 000-1 200×g离心10分钟，取上清（该上清不得有絮状物沉淀）。

    指示红细胞制备  冻干指示红细胞现配现用，用1 ml生理盐水溶解后，再用生理盐水洗涤3次（1 000-1 200×g离心1分钟），最后用1 ml红细胞保存液配置指标红细胞，溶解后的冻干指示红细胞最好当日用完，若需保存，可在4℃条件下，保存2周，但在使用前必须做空白对照实验（仅将指示红细胞加入微柱凝胶卡中）离心结果为阴性方可继续使用。

    检测步骤  ①取微柱凝胶抗人球蛋白试验卡，标记1、2、3、4、N、P（1、2、3、4指受检标本、N指阴性对照、P指阳性对照）。②将标记1、2、3、4孔依次加入受检者血清、稀释液、裂解血小板、指示红细胞各50 μl；将标记N孔依次加入阴性血清、稀释液、裂解血小板、指示红细胞各50 μl；将标记P孔依次加入阳性血清、稀释液、裂解血小板、指示红细胞各50 μl。③将已加样的微柱凝胶卡37℃孵育15分钟。④即刻使用专用离心机1 000×g离心2分钟，1 600×g离心3分钟，然后取出肉眼观察结果。

    血小板输注效果的判断

    血小板的输注疗效主要依据输注后血小板增高指数（corrected count increment,  CCI［2，3］）判断，其公式为： 

    CCI＝(输注后血小板计数-输注前血小板计数)×

    体表面积(m2)/输入血小板总数(1011)。

    式中血小板计数单位为109/L,输后计数为输后1小时测量值，体表面积(m2)=0.0061×身高(cm)+0.0128×体重(kg)-0.01529，输注有效者CCI应大于10。

    统计学处理

    数据以百分率、±SD表示，行t检验［4］。

    结    果

    血小板抗体筛选

    对多次输注血小板（3次以上）的30例再生障碍性贫血（AA）、11例骨髓增生异常综合征（MDS）、25例白血病、20例其他病例、20名正常献血员的标本进行血小板抗体筛选，结果发现多次输注血小板的再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征等血液病病例均为阳性，25例白血病中有24例阳性(阳性率为96%)，而其他病例20个标本有1个阳性(阳性率为5%)，正常献血员20名均为阴性(阳性率为0%)(表1)。

    血小板抗体交叉配合

    对多次输注血小板患者的112个再生障碍性贫血血液标本、42个骨髓增生异常综合征血液标本、95个白血病标本进行血小板抗体交叉配合，相合标本数分别为45、20和40个，相合率占待配标本的比例分别为40.18%、47.62%和42.11%(表2)。

    血小板输注效果

    对多次输注血小板的部分病人（输注量1次均为1个治疗量或10单位，即2.5×1011），分未进行交叉配合组和已交叉配合组，分别计数血小板输注前后的血小板数量情况。 未进行交叉配合组在输注前10个标本血小板量为（8.20±3.736）×109/L；输注后为（14.6±6.151）×109/L，平均提高6.4×109/L，CCI值为4.745；t值为2.67，t0.05(18)=2.101 , t0.01(18)=2.878，p值< 0.05，有显著差异。进行交叉配合组在输注前10个标本血小板量为（7.50±3.640）×109/L，输注后为（32.00±11.314）×109/L，平均提高24.5×109/L，CCI值为18.166；t值为2.67，t0.001(18)=3.922，p< 0.001，有极显著差异(表3)。

    讨    论

    血小板表面具有复杂的血型抗原，这些抗原是由遗传决定的。通常分为两类：一类是与其它细胞或组织共有的抗原，称非特异性抗原。这类抗原主要与红细胞的ABO血型系统以及人类白细胞抗原(HLA)有关；另一类是特异性抗原，它由血小板特有的抗原决定簇组成。    血小板表面存在ABO血型系统的A抗原和B抗原，但其抗原量较红细胞少。在我国通常应用ABO同型血小板输注的办法解决这个问题。 血小板膜上存在HLAA和HLAB抗原，均属于HLA Ⅰ类抗原。

    血小板抗体包括同种抗体和自身抗体，绝大多数自身抗体是IgG，极少数为lgM或IgA。血小板同种抗体是由输血、输血小板或妊娠等同种免疫产生。当再输入血小板后，输入的血小板会被破坏或输注血小板的存活时间缩短，导致血小板减少或发生输血后紫癜。而多次输注血小板的AA、MDS患者血小板抗体阳性率高（96%），大多数输红细胞或血浆的一般其他病例抗体阳性率低（仅为5%），可见不同的输注经历（不同的成分、次数）致使血小板抗体产生不一致。

    血小板抗体筛检试验是检测受检者血清标本中是否存在血小板抗体。血小板交叉配血试验是检测血小板输血受者和供者的血型相容性；如受者的血清中有供者血小板相对应的抗体，则两者血小板血型不相容。如受者的血清中无供者血小板相对应的抗体，则两者血小板血型相容。

    关于抗体与输注无效之间的关系，一般认为，检测到的HLA和（或）HPA抗体与血小板输注无效是相关的。 为减少血小板输注无效和输血后紫癜的发生，目前所采取的对策是对患者进行血小板抗体筛选，然后根据检测出的抗体特异性来选择血小板供者，这样能暂时解决血小板输注无效的问题，但对于需长期输注的患者会产生另外的抗体，这就需要进行交叉配型。

    临床上许多原因可以影响血小板输注效果,因此需对血小板输注效果作出正确估价,以便发现问题及其原因,采取适当措施。判断血小板输注疗效的主要依据之一是输注后血小板计数增高指数(CCI)。如果输注任意血型相合血小板（表3中未配型组），虽然p<0.05，统计学上有显著的差异，但CCI值为4.745未达到输注有效的标准10，血小板计数增加不多。而配型组经过抗体筛选、交叉配合，选择血型相合而且经配型的血小板输注， p<0.001，统计学上有极显著的差异，且CCI值为18.166，大于输注有效的标准10，血小板计数增加明显［5］。这表明经过交叉配合的比未交叉配合的血小板数量提高较明显，输注效果好，可见血小板抗体有无与血小板输注有关。

    目前在我国血小板输注无效仍然是个临床难题，因此对存在免疫性因素的患者检测血小板抗体和为血小板输注无效患者选择最匹配的血小板极为重要。国内目前有关血小板抗体检测的各种技术各有利弊，缺乏统一的操作程序，因此对该领域技术还需继续探索研究，不断完善。

    致谢：本课题由宁波市鄞州人民医院等6大医院输血科提供临床检测结果数据，谨此表示感谢!

【参考文献】1朱忠勇. 实用医学检验学. 北京：人民军医出版社 ， 1998：126-127

2田兆嵩. 临床输血学（第二版）. 北京：人民卫生出版社 ， 1998：35-36

3方檀，杨岩，王初. 血小板配型处理免疫性血小板输注无效10例观察. 吉林医学，2005； 26：1338-1339

4许世谨 等.医学统计方法. 上海：上海科学技术出版社 ， 1979：29-34

5陈玖，胡荣花，方建. 免疫性血小板输注无效12例处理. 中国输血杂志，2004； 17：55-56