重组狗凝血因子Ⅷ的慢病毒介导体外表达的研究

作者：孙海英，程海，李振宇，杜冰，曾令宇，鹿群先，何徐彭，潘秀英，徐开林    作者单位：徐州医学院附属医院血液科，徐州 221002

【摘要】  本研究的目的是制备携带狗凝血因子Ⅷ（cFⅧ）基因的慢病毒载体，探讨慢病毒载体能否介导cFⅧ在体外的有效表达。用构建携带cFⅧ基因的慢病毒载体pTK161（含PUB启动子）和pTK162（含2OH1启动子），同时构建含绿色荧光蛋白（GFP）的慢病毒载体pTK161′（含PUB启动子）和pTK162′（含2OH1启动子）的方法，分别与包装质粒ΔNRF、包膜蛋白质粒VSVG共转染293T包装细胞，将包装好的病毒颗粒再感染293T细胞，检测病毒滴度和培养细胞上清中cFⅧ活性。结果显示：经限制性酶切鉴定，成功构建了pTK161、pTK162、pTK161′和pTK162′正向连接载体；pTK161′和pTK162′的病毒滴度分别为1.54×106 U/ml和2.83×106 U/ml；pTK161、pTK162感染靶细胞后24小时细胞上清中即可检测到cFⅧ的表达，72小时表达量达高峰。pTK162载体cFⅧ表达活性接近正常狗血浆FⅧ活性，而且明显高于pTK161(p<0.05)，6周后cFⅧ表达活性仍达最高值的1/4。结论：构建的自身失活慢病毒载体可携带较大片段的cFⅧ基因，并在体外可获得有效表达；本研究为慢病毒载体介导的血友病A的基因治疗研究提供实验依据。

【关键词】  慢病毒

     Expression of Recombinated Canine Factor Ⅷ In Vitro Mediated by  Lentiviral Vector

    SUN HaiYing，CHENG Hai， LI ZhengYu, DU Bing，ZENG LingYu，LU QunXian，HE XuPeng，

    PAN XiuYing，XU KaiLin

    Department of Hematology, Affiliated  Hospital  of  Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002, China

    Abstract    The study was purposed to prepare the recombinant lentiviral vector pTK161 and pTK162 carrying Bdomaindeleted canine factor (BDDcFⅧ) gene, and to investigate whether the canine FⅧ(cⅧ) can be expressed in vitro. The BDDcFⅧ gene was ligated behind PUB and 2OH1 promotors to create lentiviral vectors  pTK161 and pTK162. Meantime lentiviral vectors pTK161′ and pTK162′ were  produced  by cloning a green fluorescent protein (GFP) into pTK151 and pTK152, which was driven by PUB and 2OH1 promotors respectively. Vector supernatant were prepared by using transfer calcium phosphate mediatedcotransfection of 293T cells. The virus vector, ΔNRF packagingplasmid, and VSVG envelopeplasmid was assayed by titers and cFⅧ activity in cell culture supernatant after infection into  293T cells. pTK161, pTK162, pTK161′ and pTK162′were identified by restriction enzyme analyzing. The results showed that the lentiviral vectors pTK161,pTK162, pTK161′ and pTK162′ were successfully constructed, and  the titers of pTK161′and pTK162′ reached to 1.54×106 U/ml and 2.83×106 U/ml; the activity of cFⅧ could be detected at 24 hours after  infection of 293T cells  by pTK161  and pTK162, and achieved the highest level at 72 hours later. The higher level of cFⅧ activity was achieved by transfected with pTK162 than that of  pTK161 (p<0.05), which  closed to the cFⅧ activity in normal dog plasma. 1/4 of the highest level could be detected 6 weeks later.  It is concluded that  the prepared HIV1based lentiviral vectors can  infect 293T cells to express cFⅧ effectively. The results provide the basis for further studying  HIV1based lentiviral vector gene therapy for hemophilia A.

    Key words     lentiviral vector；canine factor Ⅷ；hemophilia A；gene therapy

    J Exp Hematol 2007; 15(4):845-848

    血友病A是凝血因子Ⅷ（FⅧ）基因缺陷导致凝血因子Ⅷ缺乏的X隐性连锁的出血性疾病。目前该病的治疗方法主要是输注血浆源性FⅧ制品或基因重组FⅧ产品，这种蛋白替代疗法疗效肯定，但存在费用昂贵、血源性病毒感染、反复输注会产生抑制性抗体等许多棘手的问题［1-3］。由于血友病A是一种单基因遗传病，基因治疗可望成为一种有效治疗手段［4］。 本研究分别构建了含有 PUB 启动子和2OH1启动子cFⅧ的慢病毒表达载体pTK161和pTK162，采用三质粒包装系统，检测感染细胞上清中的cFⅧ活性，为血友病A慢病毒载体介导基因治疗寻求有价值的实验依据。

     主要试剂

    各种工具酶、1 kb DNA Ladder、质粒小量提取试剂盒WizardTM Plus SV Minipreps DNA Purification Systerm、目的基因纯化试剂盒WizardTM PCR DNA Purification System、线性化载体纯化试剂盒WizardTM DNA CleanUp System均购自Promega 公司，凝血因子FⅧ活性检测试剂盒Coamatic○R   Factor Ⅷ购自Chromogenix公司。

    质粒、菌种、包装细胞

    慢病毒载体pTK151（含有PUB启动子）、慢病毒载体pTK152（含有2OH1启动子）由本室构建，pBKCMV（含B区缺失型FⅧcDNA，BDDFⅧcDNA）由北卡大学基因治疗中心晁恒军博士惠赠，包装质粒ΔNRF、包膜质粒VSVG、感受态大肠杆菌、包装细胞293T等均由本室制备或保存。

    载体的构建及鉴定

    用Xba I和EcoR V双酶切pBKCMV，得到4 400 bp的BDDFⅧcDNA片段,用低熔点凝胶进行电泳，WizardTM PCR DNA Purification System 纯化后作为插入片段。用Xba I和Hpa I双酶切pTK151，与纯化后的BDDFⅧcDNA片段进行连接反应，连接后的载体用BamHⅠ酶切鉴定，将正确的载体命名为pTK161。用Afe I单酶切pTK152，CIAP去5′P，WizardTM DNA CleanUp System纯化后，将插入片段BDDFⅧcDNA插入到pTK152的Afe I酶切位点上，连接后载体用BamHⅠ鉴定，将正确的载体命名为pTK162（图 1）。

    Figure 1.   Construction  map  of  Lentiviral  vector  including  BDDFⅧcDNA.  重组慢病毒的包装

    采用磷酸钙共沉淀法［5］将重组质粒pTK161、pTK162（各15 μg）分别与包装质粒ΔNRF（10     μg）、包膜蛋白质粒VSVG（5 μg）共转染293T细胞，用含10%胎牛血清的DMEM培养过夜，12小时后更换 无血清培养液，于37℃、5% CO2条件下 继续培养。60小时后收集病毒上清，过滤后-80℃保存。此外，在pTK151的PUB后插入绿色荧光蛋白（GFP）基因（pTK161′）和在pTK152的2OH1后插入GFP后（pTK162′），观察GFP表达情况。

    病毒滴度的测定

    将293T细胞按照2×105/孔接种于6孔板上，吸附6小时后，将所收集的含pTK161′和pTK162′病毒上清分别按对数级稀释，将1 ml稀释后的病毒上清分别加入到相应的孔中，过夜培养后，更换培养液，48小时后，于荧光显微镜下计数荧光阳性细胞个数，用下面的公式计算病毒滴度，并用流式细胞仪（FACS）检测GFP阳性细胞百分率。

    病毒滴度（U/ml）=GFP阳性细胞数×

    相应的稀释倍数［6］

    狗的凝血因子FⅧ活性测定

    用pTK161和pTK162感染293T细胞后在不同时间点收集细胞上清，按照Coamatic○R  Factor Ⅷ试剂盒操作说明，用发色底物法检测细胞上清中cFⅧ的活性，以感染前的细胞上清作为空白对照，并以正常狗的混合血浆作为参比血浆，绘制标准曲线（选择0-1.5 U/ml范围），将测得的分光光度值在标准曲线上读数。

    结    果

    重组载体的鉴定

    用BamH I酶切鉴定慢病毒载体pTK161，正确连接的载体酶切片段应为974、2 574、10 000 bp，第1、3、7泳道的片段与期望值相符，是连接正确的pTK161（图2A），保存正确克隆。用BamH I酶切鉴定慢病毒载体pTK162，正向连接载体的酶切片段为974、2 539、9 400 bp、反向片段为900、974、10 000 bp。第1、4、5、6、7泳道为正向连接的载体,第2泳道为反向连接（图2B），保存正向克隆。

    转染后绿色荧光蛋白表达情况

    采用磷酸钙共沉淀法将pTK161′和pTK162′分别与Figure 2.  Electrophoretogram of pTK161、pTK162.

    ΔNRF、VSVG共转染293T包装细胞，24小时后即可观察到GFP的表达，72小时后GFP荧光强度明显增强，72小时后慢病毒载体pTK162′的绿色荧光蛋白表达见图3。将293T细胞作为靶细胞，感染后72小时，用FACS分析GFP表达情况。结果显示，pTK162′的感染效率较高,达25%；pTK161′的感染效率较低，为15%，两者比较有显著性差异(p<0.05)（图4）。

    病毒滴度

    将293T细胞按照2×105/孔接种于6孔板上，培养6小时后加入病毒上清，72小时后测定病毒滴度, pTK161′为1.54×106 U/ml，pTK162′为2.83×106 U/ml。

    细胞上清中cFⅧ活性

    将包装好的病毒颗粒感染293T细胞，24小时后细胞上清中即可检测到cFⅧ表达，72小时表达量达高峰。含2OH1启动子的pTK162表达量最高为1.46±0.01  U/ml，含PUB启动子的pTK161表达量为1.15±0.06   U/ml（图5），两者比较有显著性差异(p<0.05)。含正常狗FⅧ血浆的检测浓度为1.50  U/ml。将感染的293T细胞传代培养，每周分离2次，6周后仍可测定到cFⅧ活性，约为72小时的1/4。

    讨  论

    基因治疗是将正常基因或者有治疗作用的基因通过一定的方式导入靶细胞，并使其表达具有生物活性的物质，从而达到治疗疾病的目的。血友病A具有许多有利于基因治疗的优势，是实施基因治疗的首选病例之一［1-3］。目前国内外血友病A基因治疗主要采用逆转录病毒载体、腺病毒载体及腺相关病毒载体，然而逆转录病毒载体存在宿主范围窄、仅能感染分裂细胞、容纳外源性目的基因的DNA片段长度一般不超过8 kb等缺陷，腺病毒载体存在不能整合到染色体上、在体内不能稳定长期表达、反复应用容易引起免疫反应等不足，腺相关病毒虽然能够携带较大的基因片段，但是存在着感染效率低等问题［7］。这些缺陷在一定程度上限制了基因治疗的临床应用。来源于人类免疫缺陷病毒1（HIV1）的慢病毒载体由于具有感染效率高，载体容量大，靶细胞范围广等特点，在基因治疗中逐渐受到人们的重视［8,9］，但慢病毒载体的安全性仍是不可忽视的问题。我们在实验中将慢病毒载体进行了改造和优化，建立了新一代自身失活的慢病毒载体，采用三质粒包装系统［6］，大大提高了病毒的安全性，减少了产生自我复制能力的病毒颗粒的机会。

    我们成功构建了慢病毒载体pTK161′、pTK162′，重组载体与包装质粒、包膜蛋白质粒一起共转染293T细胞，24小时后即可观察到荧光蛋白表达，72小时后GFP荧光强度明显增强。Xu等［10］报道,经过超速离心后，病毒滴度可达到109  U/ml，能够满足临床治疗的需要。我们构建的pTK161、pTK162均获得了较高活性的cFⅧ表达，表达高峰与正常狗血浆cFⅧ活性相近，达到了有效治疗浓度，传代靶细胞42天后cFⅧ活性仍维持在初始浓度的1/4，这为进一步研究打下了基础。

    以病毒载体为基础的治疗方案中，载体的转染效率、病毒感染靶细胞的能力、目的基因在靶细胞中的表达水平和持续时间等都是基因治疗中值得关注的问题［11］。本研究构建的携带cFⅧ的慢病毒载体pTK161、pTK162是由不同的启动子驱动目的基因表达的。检测结果显示，含2OH1启动子的pTK162表达量高于含PUB启动子的pTK161，提示不同启动子对目的基因的表达强度有着重要的影响，今后仍要加强对内部启动子的筛选。

    综上所述，我们成功构建了携带cFⅧ的慢病毒载体，经过三质粒包装系统包装后，感染靶细胞可获得cFⅧ有效表达，为慢病毒载体介导血友病A的基因治疗提供有价值的实验依据。

【参考文献】1Ponder KP. Novel therapies for hemophilia A. Blood 2003; 12: 3857-3858

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3High KA. Gene transfer as an approach to treating hemophilia. Circ Res, 2001; 88:137-144

4Tonn T, Herder C, Becker S, et al. Generation and characterization of human hemapoietic cell lines expressing factor Ⅷ. J Hematother Stem Cell Res, 2002;11:695-704

5Chen CA, Okayama H. Calcium phosphatemediated gene transfer: a high efficient transfection system for stably transforming cells with plasmid DNA. Biotechniques,1988;6:632-638

6李振宇，徐开林，潘秀英等. HIV1慢病毒载体的构建及结构改造.中华血液学杂志，2004;25：571-572

7VandenDriessche T, Vanslembrouck V, Goovaerts I, et al. Longterm expression of human coagulation factor Ⅷ and correction of hemophilia A after in vivo retroviral gene transfer in factor Ⅷdeficient mice. Proc Natl Acad Sci USA, 1999; 96:10379-10384

8Park F, Ohashi K, Kay MA. Therapeutic levels of human factor Ⅷ and IX using HIV1based lentiviral vectors in mouse liver. Blood, 2000; 96:1173-1176

9VandenDriessche T, Thorrez L, Naldini L, et al. Lentiviral vectors containing the human immunodeficiency virus type1 central polypurine tract can efficiently transduce nondividing hepatocytes and antigenpresenting cells in vivo. Blood, 2002; 100: 813-822

10Xu K, Ma H, McCown TJ, et al. Generation of a stable cell line producing hightiter selfinactivating lentiviral vectors. Mol Ther, 2001;3:97-104

11Tomanin R, Scarpa M. Why do we need new gene therapy viral vectors? Chatacteristics,limitations,and future perspectives of viral vector transduction.Curr Gene Ther, 2004; 4: 357-372