儿童急性淋巴细胞白血病核转录因子κB的表达及其意义

作者：薛天阳, 许伟, 安琪1, 武怡, 徐春萍, 张晓艳    作者单位：徐州医学院附属医院儿科, 徐州 221002

【摘要】  为了探讨儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）NFκB P65蛋白的表达及意义，应用SP免疫组织化学法检测32例ALL患儿和40例非血液病的对照儿童NFκB P65蛋白的表达。结果表明： 32例ALL患儿的NFκB P65蛋白的阳性表达率为87.50%（28/32），表达定位于ALL细胞的胞核及胞浆中，阳性表达率明显高于对照组12.50%（5/40），两者比较有显著性差异（χ2＝40.28， p＜0.01）。在28例ALL患儿组阳性表达者中，弱阳性表达（+）占10.71%（3/28），阳性表达（++）占42.86%（12/28），强阳性表达（+++）占46.43%（13/28）。正常对照组均为弱阳性表达（5/5），两者表达程度经Ridit分析差异有显著意义（p＜0.01）。ALL病程间（初发或复发）、免疫表型间（T系ALL与B系ALL）、各细胞形态学间的表达程度差异均无显著意义（p＞0.05，四格表精确概率法）。结论： NFκB P65蛋白表达于儿童ALL细胞中，抑制NFκB信号传导途径可能在儿童ALL治疗中有重大价值，这为临床寻求以NFκB为靶点的治疗手段提供了科学依据。

【关键词】  核转录因子κB

    Expression   of  Nuclear  Transcription  Factor κB  in  Childhood  Acute  Lymphoblastic  Leukemia and Its Significance

    XUE TianYang,  XU Wei,  AN Qi1,  WU Yi,  XU ChunPing,  ZHANG XiaoYan

    Department  of  Pediatrics,  Affiliated  Hospital  of  Xuzhou  Medical  College,  Xuzhou  221002,  China；  1Xuzhou  Children  Hospital,  Xuzhou  221006,  China

    Abstract    To  investigate  the  expression of  nuclear  transcription  factor κB(NFκB)  in  childhood  acute  lymphoblastic  leukemia(ALL)    and  its  significance,   the  biotinstreptavidin  method  and microscopy were   used  to  detect  NFκB  P65  protein  in cells from   32  childhood  ALL  patients  and  40    children  without hematologic malignancies as  control. The  results   showed  that  the  positive  expression  rate  of  NFκB  P65  protein  in  cells from  32 childhood  ALL  patients  was  87.50%,  obviously  higher  than  that  in  control  group  (12.50%)  (χ2＝40.56， p＜0.01).  In 28 childhood  ALL patients with positive expression，  the  ratio  of  weakly  positive（+） cases  to  all  positive  cases   was  10.71%（3/28）;  the ratio   of   generally  positive（++） case  was  42.86%（12/28），  and  the  ratio  of  strongly  positive（+++）cases   was  46.43%（13/28）. While  in  the  control  group  the    of  NFκB P65  protein  showed low expression with  100%（5/5）. There  was significant  difference  in  the level of  NFκB P65  protein  between  ALL  patients  and   control  group.  While  the  level  of  NFκB P65  protein  had  no significent difference in morphology,  immunophenotype （Tlineage  ALL  and  Blineage  ALL） and  the  courses   in  the  de novo  and  the  relaspsed  cases.  It  is  concluded  that  NFκB  P65 protein  expresses  in  cells of  childhood  ALL, the   inhibition  of  NFκB  transduction  pathway  may  have  significant  value  in  childhood  ALL  treatment.  This study   provides   experimental  basis   concerning  clinical  treatment  for  ALL,   when   NFκB  is  taken  as  a  target.

    Key words    NFκB; NFκB P65 protein;   acute lymphocytic leukemia

    J Exp Hematol 2007; 15(4):767-771

    目前认为核转录因子κB（nuclear transcription factor κB, NFκB）在肿瘤的发生、发展中起重要作用。我们采用SP免疫组织化学法检测32例急性淋巴细胞白血病（ALL）患儿和40例正常儿童NFκB P65蛋白的表达，以探讨儿童ALL  NFκB P65蛋白表达的意义，为临床寻求以NFκB为靶点的治疗手段提供科学依据。

    材料和方法

    临床资料

    32例急性淋巴细胞白血病患儿为2003年1月-2006年5月徐州医学院附属医院儿科及徐州市儿童医院的住院患儿，其中男22例，女10例；年龄1岁3个月-13岁，中位年龄6.2岁。按细胞形态学分类： L1型21例、L2型6例、L3型4例、淋巴肉瘤白血病1例。按免疫表型分类： T细胞型ALL 5例， B细胞型ALL 27例。按病程分类： 26例为初发病例，6例为复发病例。诊断标准均按照2006年"小儿急性淋巴细胞白血病诊疗建议"［1］，所有患儿实验前至少2周未用任何化疗药物，至少1周未用过抗生素。对照儿童来自徐州医学院附属医院儿童外科手术患儿，年龄、性别与急性淋巴细胞白血病患儿相匹配，共40例，其中男23例，女7例；年龄1岁2个月-14岁，中位年龄6.8岁，对照患儿疾病种类有腹股沟斜疝、鞘膜积液、脂肪瘤、先天性斜颈、直肠息肉、先天性心脏病等。采血均在手术前进行。这40名对照儿童均无血液病史及其他肿瘤史，实验前1周无服药和感染史。

     一抗(小鼠抗NFκB P65单克隆抗体)购于Santa Cruz公司，SP免疫组织化学试剂盒和浓缩型DAB试剂盒由北京中山生物技术有限公司提供，淋巴细胞分离液购于华美生物工程公司。

    实验方法

    取患儿化疗前骨髓2 ml或外周血4 ml（WBC＞20.0×109/L，幼稚细胞＞60％），分离单个核细胞，取50 μl细胞悬液滴于防脱胶（10%的多聚赖氨酸）处理的玻片上或骨髓直接涂片（幼稚细胞占0.80以上），自然干燥，冷丙酮固定10分钟。对照组以同法制备标本。用SP免疫组织化学法检测NFκB P65蛋白表达率。

    SP免疫组织化学检测  细胞涂片或滴片经冷丙酮固定10分钟后，用PBS冲洗3分钟，3次。3%过氧化氢孵育20-30分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。用蒸馏水冲洗，以PBS浸泡5分钟。滴加封闭用正常山羊血清工作液，室温孵育10-15分钟，倾去，勿洗。滴加1∶50比例稀释的一抗（小鼠抗人NFκB P65单克隆抗体），同时以PBS代替一抗作为阴性对照，4℃过夜。用PBS冲洗3分钟，3次。滴加二抗（生物素标记羊抗小鼠工作液），37℃孵育10-15分钟。用PBS冲洗3分钟，3次。滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液，37℃孵育10-15分钟。用PBS冲洗3分钟，3次。DAB显色剂显色。自来水充分冲洗，苏木素复染，封片。

    结果判定  显微镜下细胞质和细胞核均出现棕黄色颗粒为NFκB P65亚单位表达的阳性细胞。油镜下计数至少500个细胞，阳性细胞数＜5%为(-)；5%-25%为(+)；25%-50%为(++)；＞50%为(+++)。

    统计学处理

    数据由SPSS统计软件处理： SP免疫组织化学实验结果应用χ2检验、校正χ2检验、四格表精确概率法分析。实验数据以均数±标准差（ ±SD）表示。检验水准α=0.05， p＜0.05为统计学差异有显著性。

    结    果

    NFκB P65蛋白在儿童ALL细胞中的表达

    细胞质和细胞核均出现棕黄色颗粒为NFκB P65蛋白表达阳性细胞。阴性对照无着色（图1）。NFκB P65蛋白的表达及表达程度的分布见表1。对照组骨髓/外周血单个核细胞NFκB P65蛋白阳性表达率为12.50%（5/40）。 ALL患儿组阳性表达率为87.50%（28/32），明显高于对照组，两者比较有显著性差异（χ2＝40.28， p＜0.01）。在ALL患儿组

    Figure 1. Positive  expression of  NFκB  P65  protein in  nuclear  and  cytoplasm  of  childhood  ALL  cells.  A:  positive  expression  of  NFκB  P65  protein（+++）(DAB staining×100). B: positive  expression  of  NFκB  P65  protein（+++）(DAB staining×400). C: positive  expression  of  NFκB  P65 protein（++）(DAB staining×100).  D: positive  expression  of  NFκB  P65  protein（+）(DAB staining×100).

    阳性表达者中，弱阳性表达（+）占10.71%（3/28），阳性表达（++）占42.86%（12/28），强阳性表达（+++）占46.43%（13/28）；对照组均为弱阳性表达（5/5），两者阳性表达程度经Ridit分析差异有显著意义（p＜0.01）。

    NFκB p65蛋白表达在儿童ALL病程、免疫表型、各细胞形态学方面的差异

    初发ALL患儿中NFκB p65蛋白的阳性表达率为84.62%（22/26），其中弱阳性表达占13.64%（3/22），阳性表达占45.45%（10/22），强阳性表达占40.91%（9/22）；复发ALL患儿NFκB p65蛋白阳性表达率为100.00%（6/6），其中弱阳性表达为0，阳性表达占33.33%（2/6），强阳性表达占66.67%（4/6）。初发与复发ALL两者阳性表达率比较，经四格表精确概率法检验无显著性差异（p= 0.566）。

    T系ALL患儿中NFκB p65阳性表达率为80.00%（4/5），其中阳性与强阳性表达各占50.00%（2/4）；B系ALL  NFκB p65阳性表达率为88.89%（24/27），其中弱阳性表达占20.83%（5/24），阳性表达占37.50%（9/24），强阳性表达占41.62%（10/24）。T系ALL与B系ALL患儿两者阳性表达率比较，经四格表精确概率法检验无显著性差异（p =0.512）（表2）。

    L1型ALL  NFκB p65阳性表达率为85.71%（18/21），其中弱阳性表达占16.67%（3/18），阳性表达占38.89%（7/18），强阳性表达占44.44%（8/18）；L2型ALL NFκB p65阳性表达率为83.33%（5/6），其中弱阳性表达占40.00%（2/5），阳性表达占60.00%（3/5），强阳性表达为0；L3型ALL NFκB p65阳性表达率为100.00%（4/4），其中弱阳性表达为0，阳性与强阳性表达各占50.00%（2/4）；淋巴肉瘤白血病阳性表达率为100.00%（1/1）。从ALL各细胞形态学间看NFκB p65蛋白表达程度经四格表精确概率法检验差异无显著意义（p＞0.05）（表3）。

    讨    论

    NFκB是1986年Sen和Baltimore［2］首先从成熟B淋巴细胞核抽提物中发现的。它是一种能与免疫球蛋白κ轻链基因增强子κB序列（5'GGGACTTTCC3'）特异性结合，调节其基因表达的核蛋白因子称之为NFκB。随后的研究表明，NFκB几乎存在于所有类型的细胞中。NFκB的生物学功能十分广泛，参与炎症、免疫、应激等众多基因的表达调控。最近研究发现NFκB在肿瘤的发生、发展中起重要作用，它可调控细胞的增殖、分化、凋亡与恶性转化［3］。

    目前对于成人肿瘤组织中NFκB的活化与作用研究较多，但是有关儿童ALL中NFκB的组成性活化国内外研究甚少。本研究中主要采用免疫组织化学方法检测儿童ALL细胞NFκB P65 蛋白的表达，以探讨NFκB在儿童ALL发病中的作用和意义。我们的研究结果显示：在大部分儿童ALL细胞中（17/20）存在有NFκB的表达 ，且多为阳性-强阳性（++-+++）表达，与对照儿童相比，差异有显著意义。崔龙等［4］研究认为，当多种刺激引起NFκB组成性活化时，只有10％-20％的Rel A可易位进入细胞核，而80%-90%的Rel A仍存留于细胞质中。而NFκB P65单克隆抗体不仅识别活化后存在于细胞核中的Rel A，也能识别活化后存在于细胞质中的Rel A，因此NFκB组成性活化的细胞胞质和胞核均出现阳性染色。我们的研究结果与此相符，在ALL阳性细胞细胞质和细胞核均出现阳性染色。

    Kordes等［5］用EMSA方法研究发现，大多数（39/42）儿童ALL细胞中存在NFκB的组成性活化，并且NFκB的这种活化对佛波酯（phorbol12myristate13acetate，PMA）刺激无反应，提示NFκB的活性达到最大。Kordes的研究还发现ALL细胞NFκB的组成性活化与其免疫表型、疾病初发或复发、泼尼松试验均无关。因而认为NFκB的组成性活化为儿童ALL的一个特异性特征。

    在本研究中，我们的结果显示：初发与复发ALL之间、B系ALL与T系ALL之间、ALL细胞形态学分型之间NFκB P65蛋白的阳性表达率及表达程度的分布均无显著性差异。因此，我们的研究结果与Kordes的研究结果相似，均提示NFκB的组成性活化与疾病原发或复发、免疫学分型无关。由此我们进一步推测，NFκB的组成性活化可能是儿童ALL的一个特异性特征，NFκB可能在儿童ALL的发生、发展中起重要作用。

    儿童ALL细胞中NFκB异常激活的机理尚未完全明了，有以下3种可能［6］：①NFκB的上游信号过度激活或其抑制蛋白IκB突变，继而导致NFκB的异常激活；②病毒蛋白（如EBV、HIV）可激活NFκB；并且在某些情况下，病毒蛋白诱导的NFκB活化是病毒致瘤作用所必需的；③一些癌蛋白如Ras可激活NFκB。Kordes等［5］研究发现，野生型的重组IκBα的DNA结合反应可以阻断P65P50的活化，因而认为NFκB的组成性活化并非由其抑制蛋白IκBα突变导致。那么，儿童ALL细胞中NFκB的组成性活化究竟是由其上游信号过度激活导致？还是由其他两种因素导致？这问题有待进一步的研究。

    NFκB的异常表达与肿瘤的发生、发展密切相关。当ＮＦκＢ被异常激活时，细胞正常的信号传导被改变，从而促进细胞癌变，参与肿瘤的形成发展。因此，临床上如果抑制其过度活化，便可达到治疗肿瘤的目的。

    至于NFκB的组成性活化在肿瘤细胞中的确切作用，至今还不明了。目前认为，NFκB P50P65可能通过上调促细胞存活基因表达，或抑制促凋亡基因，或活化持续性正性生长信号，从而保护细胞免于凋亡［7、8］。NFκB还可通过调控细胞黏附分子、组织纤溶酶原激活物、细胞周期蛋白等的转录表达而参与肿瘤的形成发展。Bargou等［9］的研究证实，抑制NFκB的活性，确实能够增加霍杰金氏病ReedSternberg细胞的凋亡率和减少其增殖。体外实验已经证明，NFκB抑制剂PS341有抗多发性骨髓瘤细胞的作用。至目前为止PS341已进入Ⅰ期临床试验［10］。由此可知，NFκB已成为治疗肿瘤的一个理想的靶分子［11］。

【参考文献】1顾龙君. 儿童急性淋巴细胞白血病诊疗建议（第三次修订草案）. 中华儿科杂志, 2006；44:392-395

2Sen R, Baltimore D. Multiple nuclear factors interact with the immunoglobulin enhancer sequences. Cell, 1986； 46:705-716

3Attar RM, Caamano J, Carrasco D, et al. Genetic approaches to study Rel/NFkappa B/I kappa B function in mice. Semin Cancer Biol, 1997；8:93-101

4崔龙,陈雪华，林言箴等. 腺病毒载体介导的自杀基因对MFC小鼠前胃癌细胞的体外杀伤作用. 外科理论与实践,2000；5:167-169

5Kordes U, Krappmann D, Heissmeyer V, et al. Transcription factor NFkappa B is constitutively activated in acute lymphoblastic leukemia cells. Leukemia, 2000；14:399-402

6Jo H, Zhang R, Zhang H, et al. NFkappa B is required for Hras oncogene induced abnormal cell proliferation and tumorigenesis. Oncogene, 2000； 19:841-849

7Barkett M， Gilmore TD. Control of apoptosis by Rel / NFkappaB transcriptuon factors. Oncogene, 1999；18:6910-6924

8Wang CY, Mayo MW, Korneluk RG, et al. NFkappaB antiapoptosis: induction of TRAF 1 and TRAF 2 and cIAP 1 and cIAP 2 to suppress caspase8 activation. Science, 1998； 281(5383)：1680-1683

9Bargou RC, Emmerich F, Krappmann D, et al. Constitutive nuclear factorkappaBRelA activation is required for proliferation and survival of Hodgkin's disease tumor cells. J Clin Invest, 1997； 100:2961-2969

10Teicher BA, Ara G, Herbst R, et al. The protisome inhibitor PS341 in cancer therapy. Clin Cancer Res, 1999； 59:2638-2645

11Grag A, Aggarval BB. Nuclear transcription factorkappaB as a target for cancer drug development. Leukemia, 2002；16:1053-1068