pEGFPBMI1真核表达载体的构建、鉴定及其表达

作者：陈凤花， 胡丽华， 王琳， 李一荣    作者单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院检验科，武汉 430022

【摘要】  本研究构建真核表达载体pEGFPBMI1并观察其在HeLa细胞中的表达。 将BMI1逆转录聚合酶链反应(RTPCR)产物克隆入pEGFPN1，经酶切、PCR鉴定及测序分析，构建pEGFPBMI1真核表达载体；采用脂质体转染法，将融合基因pEGFPBMI1转入HeLa细胞，用荧光显微镜和Western blot 检测其表达，SYBR Green I实时定量RTPCR方法检测转染前后HeLa细胞中P16INK4a mRNA的表达变化。结果表明： 重组后的pEGFPN1质粒已成功载入BMI1的全长编码基因，序列测定的结果与预期设计完全一致。荧光显微镜下可见在转染pEGFPBMI1的HeLa细胞中存在荧光分布；Western blot检测发现存在外源性融合蛋白BMI1EGFP的表达。在HeLa细胞中过表达BMI1显著下调P16INK4a mRNA的表达为对照组的9.2％ (P<0.01)。结论： 成功构建了真核表达质粒pEGFPBMI1，转染HeLa 细胞后可表达融合蛋白BMI1EGFP。这为今后研究BMI1在肿瘤发生发展中的机制奠定了基础。

【关键词】  基因转染

    Construction, Identification and Expression of Recombinant Eukaryotic Vector pEGFPBMI1

    CHEN FengHua, HU LiHua, WANG Lin, LI YiRong

    Department of Laboratory  Examination, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, China

    Abstract    This study was purposed to  construct and identify the mammalian expression vector of pEGFPBMI1 and to  detect whether it could express in human cervix cancer cell line HeLa.  The cDNA fragment of BMI1 obtained by RTPCR was inserted into pEGFPN1. The recombinant plasmid was confirmed by restriction enzyme digestion, PCR and DNA sequencing. pEGFPBMI1 was transfected into HeLa cells with lipofectamine 2000. The expression of pEGFPBMI1 was determined by EGFP fluorescence and Western blot analysis. SYBR GreenⅠrealtime RTPCR was used to quantitate P16INK4a mRNA. The results showed that the correct construction of the recombinant plasmid pEGFPBMI1 has been shown by restriction enzyme digestion, PCR and DNA sequencing. pEGFPBMI1 could express BMI1EGFP fusion protein in HeLa cells. Realtime RTPCR showed that P16INK4a mRNA expression was reduced to 9.2%. It is concluded that  the vector of pEGFPBMI1 has been successfully constructed and it can be expressed in HeLa cells. This work has laid foundations for further study on biological functions and potential application of BMI1.

    Key words    pEGFPBMI1; BMI1;  gene transfection;  HeLa cell;  P16INK4a

    J Exp Hematol 2007; 15(5):1056-1060

    PcG (polycomb group， PcG)基因家族以多蛋白复合体的形式调控靶基因的表达［1］，无论在果蝇还是哺乳动物的定向发育以及细胞的增殖、分化、凋亡等生命现象中都起着决定性的作用。在人类，PcG至少存在着两种不同的复合体，一种为PRC1，包括BMI1、RING1、HPH1、HPH2、HPC1、HPC2、HPC3和CtBP；另一种为PRC2，包括EED、EZH2、SUZ12、YY1和HDAC1/2。BMI1(Bcell specific moloney leukemia virus insertion site 1，BMI1)是PcG家族PRC1复合体中的重要成员，为过表达cmyc转基因小鼠中鉴定的原癌基因［2］，与果蝇PcG基因高度同源，在DNA损伤修复、细胞周期调控、染色质的稳定、基因转录激活以及细胞凋亡等方面起着重要作用。选择性敲除BMI1的小鼠可导致出生后进行性发育迟缓、神经系统的异常和严重的造血缺陷。本研究旨在构建和鉴定真核表达质粒pEGFPBMI1并瞬时转染人宫颈癌细胞系HeLa，观察其表达以及其对P16INK4a mRNA表达的影响，为进一步探讨BMI1基因的生物学作用及其机制奠定基础。

    材料和方法

    细胞培养

    真核表达载体的构建、鉴定及其表达人类乳腺癌细胞系MCF7和宫颈癌细胞系HeLa按常规培养，培养液为含10%新生牛血清的RPMI 1640，在37℃、5% CO2的孵箱中进行培养。

    试剂和仪器

    载体pEGFPN1、细胞系MCF7和HeLa以及大肠杆菌E.coli DH5α由本室保存。RPMI 1640培养液和新生牛血清购自Gibco公司。TRIZOL、Lipofectamine 2000和OptiMEM为Invitrogen公司产品。逆转录试剂、T4 DNA连接酶购自Promega公司。引物由上海博亚公司合成。各种限制性内切酶和Pyrobest 高保真酶、DNA Marker DL2000和λEcoT14  I digest DNA Marker购自大连宝生物公司。胶回收试剂盒和质粒小量抽提纯化试剂盒购自上海华舜公司。βactin和BMI1抗体分别购自美国Santa Cruz和Upstate公司。HRP标记的山羊抗小鼠IgG、HRP标记的山羊抗兔IgG、Western化学发光底物系统均为美国Pierce公司产品。20×SYBR Green I for Realtime PCR液购自上海开放科技有限公司。其它各种化学试剂均为国产分析纯产品。荧光定量PCR仪LightCycler和毛细管均为Roche公司产品。

    总RNA的提取与cDNA的合成

    总RNA的提取   取约5×106MCF7细胞离心沉淀后溶于1 ml TRIZOL后，接着按TRIZOL说明书进行操作。最后DEPC处理的蒸馏水溶解RNA，60℃孵育10分钟，立即冰浴5分钟，破坏RNA的二级结构，电泳检测RNA是否降解。

    cDNA合成  反应体系：①5×缓冲液：5 μl； ②dNTP(10 mmolL)：2.0 μl； ③Oligo(dT)15 primer (100 μg/ml)：5 μl；  ④RNasin核酸酶抑制剂(40 U/μl)：0.5 μl； ⑤MMLVRT(200 U/μl)：1 μl；    ⑥RNA模板：1-2 μg； ⑦加DEPC处理的三蒸水至25 μl。  反应条件为：25℃退火10分钟，42℃延伸60分钟合成cDNA，70℃ 10分钟灭活MMLVRT，4℃冷却5分钟。cDNA置于-20℃备用。

    引物设计及RTPCR

    引物设计  按载体pEGFPN1的要求，扩增的BMI1含启动的编码序列，无读码框内终止信号，全长为978 bp。为方便将RTPCR产物装入pEGFPN1载体中，在上游引物5' 端加上酶切位点XhoⅠ，在下游引物5' 端加上酶切位点BamHⅠ，经计算机模拟分析，引物自身不会互补或形成发夹结构。上游引物BMI1EGFPN1U： 5'CCGCTCGAGATGATGCATCGAACAACGAGAATC3'  (酶切位点：Xho Ⅰ)； 下游引物BMI1EGFPN1D： 5' CGGGATCCCGACCAGAAGAAGTTGCTGATGAC3' (酶切位点：BamHⅠ)。 上游引物含起始密码子，下游引物不含终止密码子。该引物扩增的靶序列全长1 000 bp。

    PCR反应体系  ①10×Pyrobest缓冲液：5 μl； ②dNTP(10 mmol/L)：1 μl； ③ BMI1EGFPN1U (10 μmol/L)：1 μl；  ④ BMI1EGFPN1D (10 μmol/L)：1 μl； ⑤Pyrobest 高保真酶(5 U/μl)：0.5 μl； ⑥ cDNA模板：1 μl； ⑦加灭菌蒸馏水至50 μl。阴性对照用灭菌蒸馏水代替cDNA模板。

    PCR反应条件  94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸2分钟，扩增35个循环；最后72℃延伸5分钟。

    PCR产物的克隆

    PCR产物和pEGFPN1的酶切体系  ①10×K缓冲液：5 μl； ②10×BSA：5 μl； ③Bam HⅠ(12 U/μl)：1.7 μl； ④Xho Ⅰ(10  U/μl)：2 μl； ⑤PCR产物或pEGFPN1 DNA：约2 μg； ⑥加灭菌蒸馏水至50 μl。37℃饱和酶切15-20小时。

    酶切产物的回收  双酶切的质粒DNA和PCR产物应用胶回收试剂盒回收。

    连接反应体系及条件  ①10×T4 DNA连接酶缓冲液：1 μl； ②T4 DNA连接酶(3 U/μl)：0.5 μl； ③酶切后回收的PCR产物：1 μl； ④酶切后回收的pEGFPN1：4 μl； ⑤加灭菌蒸馏水至10 μl。16℃反应8小时以上。

    质粒DNA抽提  连接产物转化感受态大肠杆菌E.coli DH5α后，在含卡那霉素的LB平板中筛选。挑取菌落后抽提质粒DNA。

    pEGFPBMI1重组体的鉴定

    质粒DNA经BamHⅠ/ Xho Ⅰ双酶切和PCR扩增鉴定，阳性克隆送上海博亚公司经ABI 3730自动测序仪进行序列分析。

    pEGFPBMI1转染HeLa细胞

    转染分为空白对照组、pEGFP－N1组和pEGFPBMI1组3 组，当细胞处于对数生长期时，以lipofectamine 2000分别转染上述质粒，转染24小时后用荧光显微镜观察EGFP的表达，Western blot检测融合蛋白BMI1EGFP的表达。SYBR Green I实时定量RTPCR方法检测转染前后HeLa细胞中P16INK4a mRNA的表达变化。P16INK4a上游引物为 5'GAAGGTCCCTCAGACATCCCC3'，下游引物为 5'CCCTGTAGGACCTTCGGTGAC3'， 61℃退火，82℃检测荧光。

    统计学分析

    数据用±SD表示，均数比较采用t检验， p<0.05认为具有统计学上的显著意义。

    结    果

    重组质粒pEGFPBMI1的构建

    采用RTPCR方法扩增消除终止密码子的BMI1基因片段，PCR的产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，符合预期片段的大小(1 000 bp）（图1）。将PCR的扩增产物纯化回收并用Bam HⅠ/ Xho Ⅰ双酶切之后插入真核表达载体pEGFPN1中，构建了重组质粒pEGFPBMI1。

    Figure 1. Electrophoresis pattern of BMI1 RTPCR. Lane 1: DNA marker DL2000. Lane 2 and 3: BMI1 RTPCR product (1000 bp). Lane 4: negative control(sterile distilled water as template.

    真核表达载体pEGFPBMI1的鉴定

    pEGFPBMI1的BamHⅠ/ Xho Ⅰ双酶切鉴定

    重组质粒pEGFPBMI1经BamHⅠ/ XhoⅠ双酶切后可获得符合预期大小的条带(约1 000 bp)(图2)。

    pEGFPBMI1的PCR扩增鉴定  随机挑选卡那霉素抗性的转化克隆，提取质粒DNA作为模板，取1 μl进行PCR扩增，蒸馏水1 μl作为阴性对照在相同条件下进行扩增。扩增产物电泳结果表明，重组载体pEGFPBMI1可特异性地扩出一条1 000 bp大小的单一DNA条带，与预期大小(1 000 bp )一致，而阴性对照未能扩增出条带，排除假阳性(图2)。

    EGFPBMI1的序列测定  将含重组质粒的阳性克隆经上海博亚公司自动测序仪进行正、反双向测定，拼接出BMI1完整序列，经blast分析，克隆获得的BMI1蛋白编码基因从起始密码子(ATG)到终止密码子（TGA）前1个密码子的序列共978 bp(前述的1 000 bp片段包括双酶切位点及保护序列)，与基因库收录的BMI1 ORF（收录号BC011652）一致。重组pEGFPBMI1载体部分测序图见图3。

    Figure 3. Partial sequencing of recombinant plasmid pEGFPBMI1.

    pEGFPBMI1融合蛋白在HeLa细胞中的表达

    质粒pEGFPBMI1 DNA转染HeLa细胞24小时后，荧光显微镜观察结果显示在转染的HeLa细胞中存在荧光蛋白表达（图4），说明基因融合后未引起报告基因EGFP的移码突变，可以认为基因的融合获得成功。Western Blot检测发现有外源的BMI1EGFP融合蛋白的表达（图5）。

    Figure 4. HeLa cells transfected with pEGFPBMI1.

    Figure 5. Expression of BMI1 and βactin detected by Western blot. 1: HeLa. 2: HeLa/pEGFPBMI1.

    pEGFPBMI1转染HeLa细胞前后P16INK4a  mRNA的表达变化

    在本研究中，应用SYBR Green I实时定量RTPCR方法检测转染前后HeLa细胞中P16INK4a mRNA的表达变化。采用2△△ct法进行数据分析，应用配对t检验进行统计学处理，发现pEGFPBMI1转染组的P16INK4a mRNA平均降低为对照组的9.2%。

    讨    论

    人类BMI1基因定位于染色体10p13［3］，此区域涉及儿童白血病的染色体易位和恶性T细胞淋巴瘤的重排。人BMI1基因结构与鼠的非常相似，包括至少10个外显子。其开放阅读框架编码326个氨基酸的蛋白质，与鼠BMI1蛋白的氨基酸序列具有98%的一致性。BMI1蛋白的氨基酸序列包括2个基序，即RING锌指结构和HTHTHT区域。前者有助于恶性转化，而后者对于BMI1发挥转录抑制效应却是必需的。

    目前研究表明，INK4aARF抑癌基因位点是BMI1在体内的一个目标位点。BMI1抑制INK4aARF编码的2种抑癌基因P16INK4a和P19ARF(在人类为P14ARF)的表达，P16INK4a抑制CDK4和CDK6诱导Rb的磷酸化，阻止细胞从G1期进入S期，直接抑制细胞增殖；P19ARF通过与Mdm2连接而阻止P53的灭活，从而诱导细胞生长停滞、细胞衰老和凋亡［4-6］。另外，BMI1也是通过抑制P16INK4a和P19ARF的表达而促进干细胞的自我更新，这可能是调节各种形式的干细胞自我更新以及出生后保持的一种普遍机理。在BMI1基因敲除的小鼠胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts, MEF) 中， P16INK4a和P19ARF的表达水平显著升高；相反，在MEF中过表达BMI1则下调两者的表达，促进其永生化［7］。作为一种原癌基因，BMI1参与肿瘤的发生，还可与其它的原癌基因如ras或myc一起促进细胞的恶性转化［8，9］。过表达BMI1也可导致细胞的肿瘤性增殖［10-13］。在乳腺上皮细胞中过表达BMI1，不通过cmyc即可诱导人类端粒酶逆转录酶的表达，从而激活端粒酶，促进其增殖和永生化［13］。但是，目前BMI1在宫颈癌中的机制研究很少。

    近年来，关于肿瘤发生发展中的基因功能研究，很多都是应用基因转染入细胞后研究。真核表达载体pEGFPN1是一个广泛应用的能表达荧光蛋白的质粒，它编码一种野生型GFP变异体。在本研究中，为了构建BMI1与EGFP融合基因的表达载体，我们选择2个pEGFPN1上常用的限制性内切酶位点XhoⅠ和BamHⅠ以及包括XhoⅠ和BamHⅠ的引物扩增BMI1 cDNA的编码序列，对BMI1基因的终止密码子进行删除。电泳结果表明，RTPCR产物符合预期大小。将该片段克隆入pEGFPN1的EGFP N端上游后，双酶切和PCR鉴定结果都提示pEGFPBMI1载体构建成功；DNA序列分析进一步表明，扩增序列正确包括起始密码子序列ATG但不含有终止密码子。pEGFPBMI1载体转染HeLa细胞后，由于二者共用1个启动序列且BMI1基因位于上游，因而报告基因EGFP的表达能够反映目的基因BMI1在细胞内表达的状况。Western Blot检测进一步证实外源性融合蛋白BMI1EGFP的表达。

    在本研究中，我们将pEGFPBMI1转染HeLa细胞后48小时收集细胞，应用实时荧光定量RTPCR检测P16INK4a mRNA的表达变化，发现P16INK4a mRNA平均降低为对照组的9.2%，提示在HeLa细胞中过表达BMI1明显下调P16INK4a的表达，促进细胞增殖。

    虽然BMI1通过组成PRC1复合体而介导其对INK4a位点的直接转录抑制已被广泛推断，但是至今仍未证实；BMI1基因调节的下游基因还有哪些等等，这些问题都需要进行大量的研究。本研究中pEGFPBMI1真核表达载体的成功构建及其在HeLa细胞内成功表达融合蛋白BMI1EGFP，无疑为这些下游研究工作奠定了基础。

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9Jacobs JJ, Scheijen B, Voncken JW, et al. BMI1 collaborates with cMyc in tumorigenesis by inhibiting cMycinduced apoptosis via INK4a/ARF. Genes Dev, 1999; 13:2678-2690

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13Dimri GP, Martinez JL, Jacobs JJ, et al. The BMI1 oncogene induces telomerase activity and immortalizes human mammary epithelial cells. Cancer Res, 2002; 62: 4736-4745