βcatenin在白血病细胞系中表达的研究

作者：麦玉洁 ，邱录贵 ，李增军 ，李新， 王国蓉，于珍，徐燕 ，王亚非 ，李茜    作者单位：大连大学附属中山医院血液科， 大连 116000

【摘要】  本研究检测βcatenin在白血病/淋巴瘤细胞系中的表达，探讨其与白血病的关系。采用半定量RTPCR、免疫细胞化学和Western blot的方法检测βcatenin在白血病细胞系中的表达。结果表明: 白血病细胞系中βcatenin在转录水平上有广泛表达，其中：在U937、KG1a、 Jurkat、K562、Namalwa细胞中存在极高表达；在HEL、HUT78、Raji、Daudi、CEM中有中等表达；而在LCLH、HL60、NB4、J61、Ramos细胞中βcatenin mRNA呈相对较低水平的表达。蛋白表达水平与mRNA表达水平结果一致。所检测的细胞系中，胞核中均可见βcatenin的表达，但程度不一;在U937、K562、KG1a 和Jurkat细胞的胞核内可见大量分布。结论: βcatenin作为WNT/βcatenin信号转导途径中重要的“调节子”，其在白血病细胞中的过量表达提示WNT/βcatenin信号转导途径可能在白血病细胞中有异常激活。

【关键词】  白血病细胞系

     Expression of βCatenin in Leukemic Cell Lines

    MAI YuJie1,2,QIU LuGui1，LI ZengJun1, LI Xin1,WANG GuoRong1， YU Zhen1, XU Yan1,

    WANG YaFei1, LI Qian1

    1State Key Laboratory of Experimental Hematology,  Institute of Hematology and  Blood Disease Hospital,  Peking Union Medical College,  Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin 300020, China; 2Department of Hematology,  Zhongshan Hospital,  Dalian University, Dalian 116000, China

    Abstract    This study was aimed to investigate the expression of βcatenin in leukemic cell lines and its relationship with pathogenesis of leukemia, semiquantitative   RTPCR and Western blot were performed to detect the expression of βcatenin in a panel of 15 human hematopoietic cell lines (U937, KG1a, Jurkat, K562, Namalwa, HEL, HUT78, Raji, Daudi, CEM, LCLH, HL60, NB4, J61, Ramos). Immunocytochemistry was  performed in some of these cell lines to detect the location of βcatenin. The results showed that the  βcatenin gene was widely expressed in most leukemic cell lines  in various  degree, the high expression of    βcatenin was found is U937, KG1a, Jurkat, K562 and Namalwa cells, middle erpression of βcatenin was observed in  HEL, HUT78, Raji, Daudi and CEM cells, lower expression of βcatenin was observed in  LCLH, HL60, NB4, J61 and  Ramos cells. The expression level of βcatenin protein was identical to the expression level of βcatenin mRNA. The expression of βcatenin could be found in nuclei of all cells mentioned above, but their levels were different belween them.  Abundant βcatenin also could  be observed in nuclei of some leukemic cells by immunocytochemistry.  It is concluded that overexpression of  βcatenin   in leukemia cells, as a key mediator of Wnt signaling transduction  pathway,    indicates that the  Wnt signaling transduction pathway may  be aberrantly activated in leukemia.

    Key words    βcatenin; leukemic cell lines; WNt/βcatenin  signaling pathway

    J Exp Hematol 2007; 15(5):919-922

    βcatenin首先是作为一种黏附分子被发现［1］。近年来越来越多的研究表明，它同时又是一种转录因子，在Wnt信号转导途径中参与基因的表达和调控［2］。其异常激活与多种实体瘤的关系已经明确，但在白血病中的作用尚未证实。我们采用半定量RTPCR、免疫组织化学及Western blot的方法检测βcatenin在白血病细胞系中的表达水平，并初步探讨其与白血病的关系。

    材料和方法

    细胞培养

    人白血病细胞/淋巴瘤细胞系：K562、HL60、NB4、 U937、 KG1a、Jurkat、HEL、CEM、Namalwa、Ramos、LCLH细胞系由本室常规保存，Raji、 Daudi、 HUT78由我所廖晓龙教授赠送。细胞生长于含10%灭活新生小牛血清、1×105 U/ ml青霉素和10 mg/ml链霉素的RPMI 1640完全培养液中，置于37℃、5% CO2 、饱和湿度培养箱内培养。人白血病细胞系J61细胞由我所吴克复教授赠赠，源自1976年1名疑似急性髓单核白血病（AMML）患者，除需在IMDM中加入20％ NCS外,其余培养条件同其他细胞系［4］。

   总RNA的提取  收集1×106细胞，以TRIzoL reagent (Invitrogen公司产品) 提取细胞总RNA, 氯仿相分离,异丙醇沉淀，乙醇洗涤RNA团块，干燥并DEPC水溶解RNA，用紫外分光光度法测定RNA的量， A260/ A280鉴定RNA纯度。

    RTPCR  以OligodT(18)法逆转录为cDNA，扩增βcatenin和内参照βactin。扩增条件:βcatenin：95℃ 30秒, 55.5℃ 30秒,72℃ 30秒， 共30个循环；βcatenin正义链：5′AGCCGACACCAAGAAGCAG     3′,βcatenin反义链：5′GGCCACCCATCTCATGTTC 3′，扩增长度808 bp；βactin(作为内参)：95℃ 30秒,　60℃ 30秒，72 ℃ 30秒，共25个循环，βactin正义链5′ATCTGGCACCACACCTTCTACA3′，βactin反义链5′GTTTCGTGGATGCCACAGGACT3′，扩增长度569 bp。引物由上海Sangon合成，PAGE纯化。

    βcatenin的半定量分析

    取PCR产物5 μl，在15 g/ L琼脂糖凝胶(含0. 5 μg/ ml溴化乙锭) 上电泳(80 V, 30分钟)后,紫外灯下观察、照相，用Kodak Digital Science 1D Image Analysis Software及GDS1数字化凝胶成像分析仪扫描，按下列公式计算βcatenin的相对表达量。

    R＝βcatenin吸光度比值/βactin吸光度比值

    免疫细胞化学染色

    采用ABC免疫酶标法进行。细胞甩片后经冷丙酮固定20分钟。然后用10% 的正常羊血清封闭20分钟,置一抗湿盒中(一抗为鼠抗人单克隆抗体，1∶50稀释，阴性对照以PBS代替)，于37℃孵育2小时。用PBS洗3次，滴加生物素标记二抗（北京中山公司产品），37℃孵育30分钟，用PBS洗3次。滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，37℃孵育30分钟，用PBS洗3次，DAB显色液中5-10分钟。苏木精复染细胞核,常规逐级乙醇脱水,二甲苯透明,中性树脂封固。

    βcatenin蛋白表达的Western blot检测

    取1×107细胞，用PBS洗涤后悬浮于RIPA裂解液中（50 mmol/L Tris，pH 8.0，150 mmol/L NaCl，1% NP40, 0.5%脱氧胆酸钠，0.1% SDS，1 mmol/L EDTA，100 mg/L PMSF，1 mg/L Aprotinin，2 mg/L Leupeptin，1 mmol/L DTT），超声裂解，10 000 rmp离心10分钟，取上清，以Bradford assay法测定蛋白浓度。取200 μg总蛋白，进行聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳，电转至硝酸纤维素膜。5％脱脂奶封闭过夜后，加入一抗（1∶1000稀释）孵育2小时，用TBST洗涤。室温孵育二抗2小时, TBST洗涤后，用ECL法检测（Santa Cruz公司）。

    统计学处理

    βcatenin相对表达量R>1.0认为高表达，0.6

    结    果

    βcatenin基因在白血病细胞系中的表达

    在所检测的15种细胞系中都可检测到βcatenin的表达，但程度不一。在U937、KG1a、Jurkat、K562、Namalwa细胞中有极高表达（R>1.0）；在HEL、HUT78、Raji、Daudi、CEM中中等表达（0.6

    βcatenin蛋白在白血病细胞系中的表达

    采用Western Blot 方法对其中12株细胞系中的βcatenin蛋白表达水平进行检测。如图3所示，同细胞系中mRNA表达水平一致：βcatenin在Jurkat、 KG1a、U937、 K562中高表达；在HUT78、Raji、HL60、CEM、Daudi呈中等水平表达；在NB4、J61、LCLH中呈相对低水平的表达。

    Figure 1.  Expression of βcatenin mRNA in leukemia/lymphoma cell lines.

    Figure 2. Relative expression  of βcatenin mRNA in leukemia/lymphoma cell lines.Figure 3. Expression of βcatenin protein in leukemia/lymphoma cell lines by Western blot.

    βcatenin在白血病细胞系中的分布

    通过ABC的方法发现在所检测的细胞系的胞核中都可见βcatenin的表达，但程度不一。在U937、K562、KG1a 和Jurkat细胞中，>50% 以上的细胞能够检测到胞核和胞浆有βcatenin的强阳性表达（图4A 和4B）；在 mRNA 水平中等的细胞系HUT78、

  讨    论

    WNT/βcatenin信号转导途径是一个对细胞的分化、迁移、增殖、极性起重要调节作用的途径［2］。它由最上游的配体WNT启动、引发细胞浆中βcatenin的聚集并进而进入细胞核内，在核内与TCF/LEF（Tcell factor/ lymphocyteenhancebindingfactor）结合而被激活［2，3］。

    作为这一经典途径中重要的“调节子”βcatenin，目前认为它是一个多功能蛋白，除了介导细胞黏附外，还是一个转录因子，参与基因表达的调节。近年来许多研究表明，βcatenin与多种实体瘤发病关系密切，但在恶性血液病中的作用目前研究尚少。Chung等［4］报道在Jurkat、 MMMolt4、SUDHL4、和SUDHL5等部分白血病/淋巴瘤细胞系中可以检测到βcatenin的高表达，最近国内也有关于βcatenin蛋白在白血病原代细胞中表达增高的报告，并认为可能与细胞的增殖有关［13］。我们对包括U937、KG1a、 Jurkat、K562、Namalwa等15种白血病/淋巴瘤细胞系中βcatenin的表达进行检测，以明确βcatenin是否在白血病中有与实体瘤中一样的高表达。RTPCR分析检测结果显示，βcatenin mRNA至少在某些白血病细胞中有中等至较高水平表达，包括髓系白血病细胞系如U937、KG1a和淋系白血病细胞系如Jurkat、K562等。Western blot检测证实βcatenin在蛋白水平上的表达基本与mRNA表达一致。但目前尚没有找出其表达水平的高低与白血病的类型或其生物学行为之间有何联系，我们推测它可能在来源更为原始的细胞中有较高表达。

    静息的细胞中有少量的βcatenin以结合状态分布于细胞膜下，介导细胞黏附，游离的βcatenin则很快被降解。但在WNT途径异常激活后，βcatenin降解受抑制，胞浆中过量的βcatenin将进入细胞核，启动多种靶基因的转录［5］。因此βcatenin在细胞中的定位与其作用密切相关，决定其参与黏附功能还是作为癌基因参与基因转录。在上皮细胞来源的多种实体肿瘤中，如在肝癌、乳腺癌、结、直肠腺癌、膀胱癌等［2，6-9］肿瘤中都可以检测到βcatenin在胞浆和/或胞核中异常高表达，提示WNT/βcatenin 途径的异常激活可能参与这些肿瘤的发生［10］。我们通过免疫细胞化学对βcatenin白血病细胞系中定位进行分析发现，在多种白血病细胞系的核内也可以检测到βcatenin，其强度与PCR结果一致。这些结果强烈提示，WNT/βcatenin 途径可能在白血病细胞中有异常激活。在我们最近的研究中发现，在慢性髓系白血病急变后βcatenin表达增高，由此它可能参与慢性髓系白血病急变机制［14］。

    Lu等［11］证实，与正常的B细胞相比，抑制慢性淋巴细胞白血病细胞βcatenin的表达，则CLL细胞生长减少。Derksen等［12］最近证明，在原代多发性骨髓瘤细胞的细胞核中也可以检测到程度不一的βcatenin的表达；并且WNT/βcatenin信号转导途径对MM细胞的生长、增殖有重要的促进作用。目前，WNT/βcatenin信号转导途径在白血病中的研究还刚刚开始，其确切作用有待于更多的研究证实。

【参考文献】1McCrea PD, Turck CW, Gumbiner B. A homolog of the armadillo protein in Drosophila (plakoglobin) associated with Ecadherin. Science, 1991;254:1359-1361

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4Chung EJ, Hwang SG, Nguyen P, et al. Regulation of leukemia cell adhesion, proliferation and survival by βcatenin. Blood, 2002; 100:982-990

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11Lu D, Zhao Y, Tawatao R, et al. Activation of the Wnt signaling pathway in chronic lymphocytic leukemia. Proc Natl Acad Sci USA, 2004; 101: 3118-3123

12Derksen PW, Tjin E, Meijer HP, et al. Illegitimate WNT signaling promotes proliferation of multiple myeloma cells. Proc Natl Acad Sci USA, 2004; 101:6122-6127

13陈胜梅，孙慧，刘延方等.β连环蛋白在急性白血病骨髓细胞的表达及其意义.中国实验血液学杂志，2006；14：460-463

14李增军, 邱录贵, 李新等.βcatenin在慢性粒细胞白血病中的表达及与BCR/ABL的关系. 中国实验血液学杂志，2007; 15: （在出版中）