白血病人骨髓间充质干细胞是否是恶性细胞？

作者：谢政军，胡灯明，王三斌， 尹波， 郑维扬，徐兵，徐晓兰，林榕，冯茹， 周淑芸    作者单位：成都军区昆明总医院血液科， 昆明 650032

【摘要】  本研究探索白血病人的骨髓间充质干细胞是否也具有白血病恶变特征。分别分离培养急性早幼粒细胞白血病（APL）及慢性髓系白血病（CML）患者的骨髓间充质干细胞并与正常对照比较其形态、生长曲线、细胞表面标志及是否带有白血病细胞的恶性克隆性的基因异常标志。结果表明： 白血病患者的骨髓间充质干细胞在细胞生物学特征方面与正常健康人无任何明显差异，未发现白血病患者的骨髓间充质干细胞带有白血病细胞的恶性克隆性基因改变。结论： 来源于白血病患者的骨髓间充质干细胞并无相应白血病细胞的克隆性异常，提示可能作为自体移植的辅助治疗和细胞治疗或基因治疗的可供选择的细胞载体。

【关键词】  骨髓间充质干细胞

     Are Leukemic Patient Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Malignant?

    XIE ZhengJun, HUDengMing, WANGSanBin, YIN Bo, ZHENG WeiYang1, XU Bing1,

    XU XiaoLan1, LIN Rong1, FENG Ru1,  ZHOU ShuYun1

    Department of  Hematology,  Kunming General Hospital,  Chengdu Military Area, Kunming 650032， China; 1Department of Hematology, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou    510515， China

    Abstract    The study was aimed to explore whether there are leukemic characteristics in the bone marrow mesenchymal stem cells（BMMSC）from leukemic patients as compared with normal controls. The  mesenchymal stem cells from bone marrow of normal volunteers and  patients with APL and CML were isolated, then cultured and proliferated in vitro. The morphology， growth curve and  cell surface markers of two different sources mesenchymal stem cells  were investigated for detecting whether the bone marrow mesenchymal stem cells derived from leukemia patients have the specific abnormal fusion gene of leukemia cells  through fluorescent in situ hybridization. The results indicated that there was no significant difference between the mesenchymal stem cells derived from different subjects,  the bone marrow mesenchymal stem cells derived from leukemia patients did not have the clonal malignant fusion gene as seen in  the leukemia cells. Taken altogether, mesenchymal stem cells derived from leukemia patients had no biological differences as compared with those from normal volunteers， and  no malignant clonal abnormality was found. It is concluded that  mesenchymal stem cells derived from leukemia patients as an alternative vehicle may be used for assistant of  autologous hematopoietic stem cell transplantation or cell therapy and gene therapy.

    Key words    Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell； Leukemia； Cytoreagent

    J Exp Hematol 2007; 15(5):913-918

    骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell, BMMSC)是来源于骨髓的一种非造血干细胞，对其研究已有30多年的历史，而且多是以来源于健康成人的骨髓间充质干细胞为研究对象。但在白血病状态下的骨髓间充质干细胞是否不同于来源于正常健康成人的骨髓间充质干细胞，由于目前国内外尚未见到相关的报道，所以尚有许多方面亟待阐明。为了了解白血病状态下骨髓间充质干细胞的生物学特征，我们以正常健康成人的骨髓间充质干细胞与急性早幼粒细胞白血病（APL）患者和慢性粒细胞白血病（CML）患者的骨髓间充质干细胞为对象，对这两种来源的骨髓间充质干细胞进行了比较研究。

    材料和方法

    研究对象

    本研究所用的BMMSC来源于4例正常健康志愿者骨髓、5例急性早幼粒细胞白血病患者骨髓、5例慢性粒细胞白血病患者骨髓。

    骨髓间充质干细胞的体外分离培养

    无菌条件下临床采集正常志愿者和按FAB分型标准诊断为APL、CML患者疾病初发时的骨髓，用DMEM  5倍稀释，400×g离心5分钟，弃上清及脂肪层，加入5 ml的DMEM，制成细胞悬液。将细胞悬液小心叠加到预先配制好的比重为1.073 g/L的Percoll分离液上；400×g离心20分钟，小心吸取界面层，加入5倍体积的0.1 mol/L PBS液，混匀，离心洗涤以除去残留的Percoll成分。以2.0×105/cm2的密度接种于BMMSC培养液（含10% FBS、100 U/ml青霉素、100 mg/L链霉素、250 mg/L两性霉素的DMEM）中，置于37℃、5% CO2、 饱和湿度的孵箱内培养。3天后更换培养液，小心弃去未贴壁细胞。以后每3天换液1次。待细胞生长到80%-90%融合度时，应用0.25%胰蛋白酶和0.01% EDTA消化后，收集细胞进行实验，部分细胞按1∶2的比例进行传代继续培养，每7-10天传代1次。

    分别取不同来源的骨髓间充质干细胞第1代（P1），第3代（P3）和第5代（P5）的BMMSC进行培养，待融合生长成单层后，用0.25%胰蛋白酶和0.01% EDTA消化后传代；同时采用含10% FBS的DMEM完全培养液按1×104个/孔细胞浓度接种于24孔板进行培养，每日取2孔进行计数，一直计数到接种后第7天，取均值绘制生长曲线。

    体外定向诱导培养

    分别取不同来源的第1代，第3代和第5代BMMSC培养至贴壁细胞融合成单层，用0.25%胰蛋白酶和0.01%    EDTA消化后，分别用脂肪诱导系统和成骨诱导系统进行培养，分别悬浮细胞，等量接种于8孔微量培养玻片上。

    定向诱导培养系统

    成骨诱导培养体系：按照Muraglia方法［1］，DMEM完全培养基、维生素C 0.05 mmol /L、β磷酸甘油钠10 mmol/L、地塞米松 10-8mol/L。每3天换液1次。诱导培养7、14、21天后分别行偶氮偶联法做碱性磷酸酶染色(alkaline phosphatase staining, ALP)，光学显微镜观察。随机取10个非重叠视野,计数200个细胞，计算碱性磷酸酶染色阳性细胞的阳性率,结果用均数±标准差（±SD）表示。

    脂肪诱导培养体系： 按照Muraglia方法［1］，DMEM完全培养基、维生素C 0.1 mmol /L、3异丁基1甲基次黄嘌呤0.5 mmol /L、地塞米松 10-6mol/L。每3天换液1次。诱导培养7、14、21天后分别行苏丹黑染色(Sudan Black staining, SB)，光学显微镜观察。随机取10个非重叠视野, 计数200个细胞，计算脂肪细胞占总细胞数的比例,结果用均数±标准差（±SD）表示。

    骨髓间充质干细胞细胞表面标志的检测

    取不同来源的第1、第3和第5代BMMSC进行培养，待生长达80%-90%融合时，弃去培养液，用0.1 mol/L PBS淋洗2遍。加入按1∶1比例配制的0.25%胰蛋白酶和0.01% EDTA消化细胞，再用含5% FBS的0.1 mol/L PBS终止消化。离心收集细胞，以3×105细胞分别与抗CD13、CD29、CD34、CD44、CD45、HLADR在室温下反应30分钟。用0.1 mol/L PBS液洗涤2次后，再分别与FITC和PE标记的二抗避光反应15分钟。将洗涤后的细胞重悬于0.1 mol/L PBS中，以备流式细胞仪器检测分析。

    白血病患者BMMSC中的恶性克隆标志检测

    PML/RARa融合基因探针(美国Vysis公司产品)

    PML探针长度约180 kb,跨越15号染色体长臂的bcr1、bcr2、bcr3等断裂区，用橙色荧光标记；RARa探针长度约400 kb，包括17号染色体长臂从第6外显子到端粒的DNA序列，而不包括第2内显子内约17 kb 的短裂区。在正常细胞的间期核中表现为2橙2绿的信号（2O2G），在有融合基因PML/RARa形成的细胞间期核中表现为1橙1绿1融合的信号（1O1G1F）。

    BCR/ABL融合基因探针(美国Vysis公司产品)  BCR探针长度约为1.2 mb,跨越22号染色体长约1.5 mb的区域,覆盖了包括Mbcr、mbcr和μbcr在内的所有断裂点,用绿色荧光素直接标记。ABL探针长度约为650 kb,覆盖9号染色体长臂侧端(3′端)的精氨基琥珀酸盐合成酶(ASS)至近着丝粒端(5′端)的第11外显子,用橙色荧光素直接标记。在无bcr/abl融合基因形成的细胞核中会观察到2橙2绿的信号（2O2G）, 而在形成bcr/abl融合基因中有Mbcr断裂的方式会观察到1个绿色信号,1个大的橙色,1个小的橙色信号和1个融合信号(2O1G1F), mbcr断裂方式参与的BCR/ABL融合基因形成则会出现1橙,1绿和2个融合信号（1O1G2F），有些在ABL的5' 端断裂则会形成一个融合基因。

    原位杂交  按说明书进行,每份标本分析300-500个细胞,分别对APL患者和CML患者的骨髓标本和其骨髓间充干细胞进行比较研究。

    数据处理

    采用SPSS 10.0进行数据处理，计量资料行配伍组方差分析，计数资料行卡方检验。

    结    果

    来源于白血病患者骨髓的间充质干细胞的形态特点

    临床获取的人骨髓标本经Percoll分离液分离后，可获得乳白色的界面细胞层。该层细胞洗涤后接种培养3天，换液除去未贴壁细胞后，可见贴壁生长的BMMSC较少，散在分布，细胞呈大而扁平的梭形，5天后贴壁细胞迅速增殖，10天后开始出现较大的克隆，18天左右细胞生长达到80%以上融合，每个克隆细胞数量可达到数百到上千。细胞呈均一的长梭形，旋涡状分布。传代后每瓶（T25）可收获6×105左右细胞。传代后细胞于1周左右融合，连续传代15代后细胞仍维持旺盛的增殖能力和典型的成纤维细胞样形态学特征。原代培养来源于健康志愿者和白血病患者的BMMSC，在体外生长规律方面无明显差别。

    来源于白血病患者骨髓的间充质干细胞的生长增殖规律

    BMMSC传代细胞的生长较原代要快,一般7天左右能达90%以上融合,细胞形态均为螺旋状排列的长梭形细胞类似成纤维细胞形态。从对P1、P3及P5代细胞生长曲线的观察发现，3代细胞具有以下共同特征:传代培养的潜伏期约为24-36小时,对数增殖期约为2-3天,对数增殖期后第5天进入平台期(图1、2 )，不同来源的骨髓间充质干细胞间的生长规律无明显差别（p＞0.05）。

    来源于白血病患者骨髓的间充质干细胞的诱导分化能力

    第7，14，21天后光学显微镜下观察发现，成骨细胞诱导分化后细胞的形态部分已变成圆形和方形，于培养的第7天碱性磷酸酶染色出现阳性，至培养的第21天阳性细胞所占比例达最高；脂肪细胞诱导分化后细胞的形态部分已变成圆形和方形，于培养的第7天苏丹黑染色出现阳性，至培养的第21天阳性细胞所占比例达最高（表1、2、3）。以上结果说明，来源于白血病患者的骨髓间充质干细胞仍具有分化为脂肪细胞和成骨细胞的能力(图3)，但与来源于正常健康志愿者的无明显差别（p＞0.05）。

    来源于白血病患者骨髓的间充质干细胞的细胞表面标志

    用流式细胞术检测了不同来源的BMMSC的多种MSC表面标志。结果表明，来源于白血病患者的BMMSC均一地表达CD13、CD29； CD44有少量表达，而CD34、CD45和HLADR为阴性。来源于正常健康志愿者的BMMSC均一地表达CD13、CD29、CD44，而CD34、CD45和HLADR为阴性（表4，5，6）。

    来源于白血病患者骨髓的间充质干细胞

    5名APL患者的骨髓白血病细胞在疾病初发时做荧光原位杂交检测均为PML/RARα阳性（100%），表现为间期核中为1橙1绿和1个的融合信号；而来源于其骨髓的间充质干细胞荧光原位杂交检测则表现为PML/RARa阴性，间期核中为2红2绿的荧光信号。5名CML患者的骨髓白血病细胞在疾病初发是用BCR和ABL 探针进行荧光原位杂交检测，

    讨    论

    白血病是一种造血干细胞的克隆性异常增殖所致的后天获得性疾病，通过染色体和基因检测一般都能发现克隆性异常的证据。它是一种恶性肿瘤性疾病。关于它的发病机制目前仍不清楚，但是有证据表明，其骨髓中支持造血的骨髓基质细胞系统的异常，如骨髓基质中的细胞因子的梯度发生变化，骨髓细胞间基质及细胞黏附分子的变化，使白血病细胞异常增生，并且异常迁徙［2-4］，在白血病的发病中起重要作用。而白血病人骨髓基质细胞系统中的间充质干细胞，是骨髓基质中多数细胞如内皮细胞、基质细胞、脂肪细胞、成纤维细胞等细胞的干细胞。它是否也存在异常，从本质上BMMSC是否具有白血病异常，至今对比仍是知之不多。

    我们的研究显示，来源于白血病人BMMSC在体外培养状态下，细胞形态和细胞增殖的规律与来源于正常健康志愿者的骨髓间充质干细胞无明显差别，其细胞表面也表达来源于正常健康志愿者骨髓间充质干细胞所表达的白细胞分化抗原，且其表达强度无衰减，急性髓系白血病人BMMSC很少表达CD44，而正常人BMMSC中CD44的表达一般较高。

    众所周知，白血病是由于造血干细胞的异常克隆变化引起的。那么，白血病患者的骨髓基质系统的缺陷是否就和BMMSC有关？我们的实验结果显示，两类有明确克隆性异常的白血病APL和CML患者的骨髓经应用荧光原位杂交技术检测证实，其白血病细胞中确实存在克隆性的基因异常改变的PML/RARa和BCR/ABL，而来源于白血病人的骨髓间充质干细胞中未检测到白血病细胞的克隆性基因异常标志。以上说明白血病来源的BMMSC从本质上未发现有恶性改变。

    目前对白血病的治疗主要是化疗、放疗和造血干细胞移植。而一些临床试验证实，大剂量的放化疗对骨髓基质细胞系统有明显的损伤［5］，而体外培养的BMMSC回输体内后，具有促进放化疗后的骨髓造血恢复，造血干细胞移植后造血干细胞的植入，造血重建［6，7］和减少GVHD发生的作用［8］。白血病来源的BMMSC假如本质上无恶性克隆性改变，且分离培养后为单一群体，无白血病细胞污染，就可能在将来临床用于自体治疗。

    以上研究虽然不能完全反映白血病状态下骨髓间充质干细胞的全貌,却证实了其并非具有和白血病细胞特征而恶性增生。朱光荣等［9］的研究表明，白血病来源的BMMSC分泌的细胞因子与正常来源的BMMSC分泌的细胞因子无差别，这也支持白血病的骨髓基质异常可能不是白血病的"源头" ［10］。如果深入研究白血病人BMMSC的基因表达谱及蛋白表达水平是否存在异常，就能更全面的了解白血病状态下的BMMSC的本质。

    目前BMMSC的分离和培养是基于Fridenstein等的方法［11］，而不同的分离方法获得的BMMSC虽然可找到一些共同特征，但也有可能因为分离方法的不同而产生的成分的差异［12］，这也提示目前我们富集的BMMSC可能还混杂有其他非造血干细胞成分，实际上是异质性干细胞群体。因此，只有将来找到一个鉴定骨髓间充质干细胞的高特异性标志，才能对其特征有全面的了解和重新认识。

【参考文献】1Muraglia A，Cancedda R，Quarto R. Clonal Mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to herarchical mode. J Cell Sci, 2000;113 ( Pt 7):1161-1166

2Tabe Y, Konopleva M, Munsell MF, et al. PMLRARalpha is associated with leptinreceptor induction: the role of mesenchymal stem cellderived adipocytes in APL cell survival. Blood, 2004;103:1815-1822

3Wetzler M, Kurzrock R, Estrov Z, et al. Cytokine expression in adherent layers from patients with myelodysplastic syndrome and acute myelogenous leukemia. Leuk Res, 1995;19:23-34

4Konopleva M, Konoplev S, Hu W, et al. Stromal cells prevent apoptosis of AML cells by upregulation of antiapoptotic proteins. Leukemia, 2002;16:1713-1724

5Drouet M, Mourcin F, Grenier N, et al. Mesenchymal stem cells rescue CD34+ cells from radiationinduced apoptosis and sustain hematopoietic reconstitution after coculture and cografting in lethally irradiated baboons: is autologous stem cell therapy in nuclear accident settings hype or reality? Bone Marrow Transplant, 2005; 35:1201-1209

6Angelopoulou M, Novelli E, Grove JE, et al. Cotransplantation of human mesenchymal stem cells enhances human myelopoiesis and megakaryocytopoiesis in NOD/SCID mice. Exp Hematol, 2003; 31:413-420

7Lee ST, Jang JH, Cheong JW, et al. Treatment of highrisk acute myelogenous leukaemia by myeloablative chemoradiotherapy followed by coinfusion of T celldepleted haematopoietic stem cells and cultureexpanded marrow mesenchymal stem cells from a related donor with one fully mismatched human leucocyte antigen haplotype. Br J Haematol, 2002;118:1128-1131

8Zeiser R, Marks R, Bertz H, et al. Immunopathogenesis of acute graftversushost disease: implications for novel preventive and therapeutic strategies. Ann Hematol, 2004;83:551-565

9朱光荣,周小玉,陆化等. 人骨髓间充质干细胞表达多种造血细胞因子. 中国实验血液学杂志, 2003;11:115-119

10Rodriguez Mdel C, Bernad A, Aracil M. Interleukin6 deficiency affects bone marrow stromal precursors, resulting in defective hematopoietic support. Blood, 2004; 103:3349-3354

11Quirici N, Soligo D, Bossolasco P, et al. Isolation of bone marrow mesenchymal stem cells by antinerve growth factor receptor antibodies. Exp Hematol, 2002;30:783-791

12Baksh D, Song L, Tuan RS. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med, 2004; 8:301-316