11例急性巨核系白血病患者巨核细胞的超微结构分析

作者：茹永新， 赵轼轩， 刘津华， 秘营昌， 竺晓凡， 王慧君， 王建祥    作者单位：中国医学科学院、中国协和医科大学、血液学研究所、血液病医院，天津 300020

【摘要】  为了研究急性巨核细胞白血病患者骨髓中幼稚巨核细胞的超微结构特点，根据电子显微镜观察结果，回顾性分析11例急性巨核白血病患者骨髓巨核细胞的形态结构和血小板过氧化物酶（PPO）表达情况。结果表明： 11例中7例例巨核细胞直径在20 μm以内，其中2例细胞直径10-15 μm， PPO阳性率50%以上，大部分细胞外形规则，大小均匀，表面突起少，核不规则，核质比大，胞浆颗粒细小，分界膜发育不完全，管道排列无规律；5例巨核细胞直径20 μm左右，PPO阳性率在8%-22%之间，核呈圆形或马蹄形，异染色质不等，其中3例无幼稚分界膜和致密颗粒，2例偶见。11例中5例细胞直径在20-40 μm之间，PPO阳性率16%-80%，大细胞表面有不规则突起，核质比不等，核不规则，异染色质多，核仁不明显，胞质有成熟分界膜结构、管道系统和成熟α颗粒。结论：大部分患者巨核细胞以Ⅰ期分化阶段为主，少数病例伴有少量Ⅱ、Ⅲ期细胞；相同或不同患者骨髓中未成熟巨核细胞的发育程度存在差异。

【关键词】  急性巨核细胞白血病

     Ultrastructural Characteristics of  Megakaryocytes in 11 Patients with  Acute Megakaryocytic Leukemia

    RU YongXin， ZHAO ShiYuan， LIU JinHua， MI YingChang， ZHU XiaoFan， WANG HuiJun， WANG JianXiang

    Institute of Hematology and  Blood Diseases Hospital, Union Medical University of China,  Chineses Academy of Medical Sciences, Tianjin 300020, China

    Abstract    The purpose of study was to  investigate the ultrastructural features of leukemic megakarocyte (LMK)  in patients with  acute megakaryocytic leukemia (M7).  Analyzing the ultrastructure characteristics of LMK and positive ratio of platelet peroxides (PPO) in 11 patients with M7 were analyzed  on basis of transmission electron microscopic observation retrospectively. The results showed that  the diameter of LMK in 7 out of 11 cases  was less than 20 μm, in 2 cases of them, the LMK diameter was from 10 to 15 μm and their PPO positive ratio was more than  50%, most LMK displayed  regular shape, less protrusions, irregular nucleus, high nuclear/cytoplasm ratio, tiny granules, undeveloped demarcation membrane system (DMS) and irregular tubules in cytoplasm; in 5 out of those 7 cases  the diameter of LMK was about 20 μm, PPO positive cell count  was from 8% to 22%, most showing round or horseshoe nuclei, more or less heterochromatin, no DMS and granules were found in LMK in 3 cases and 2 cases occasionally. In other 5 out of 11 cases, the diameter of LMK was from 20 to 40 μm and PPO positive ratio was  from 16% to 80%, in which smaller LMKs were similar to those in former cases  in shape, and the larger LMK had irregular protrusions, varied nuclear/cytoplasm ratio, more heterochromatin, prominent nucleolus, some of them contained developed DMS, tubules and αgranules. It is concluded that most  patients with M7 are predominant of LMK in stageI and minority contained LMK in II or III stage simultaneously. The differentiation degrees of LMK are different in individual and  various cases.

    Key words    ultrastructure; acute megakaryocytic leukemia; differentiation

    J Exp Hematol 2007; 15(4):720-723

    急性巨核细胞白血病1985年被列入FAB分类（AMLM7），占AML发病率的5%-10%［1］。国内临床和科研人员用光学显微镜对白血病巨核细胞的形态进行了仔细观察,发现在白血病过程中巨核细胞形态变异很大并且把细胞多形性作为临床诊断M7的标准之一［2］。事实上光学显微镜只能识别高分化幼稚巨核细胞，难以全面反映恶性细胞的超微结构和分化程度。本研究对2000至2005年之间本院的11例AMLM7住院患者的骨髓未成熟巨核细胞进行回顾性电子显微镜观察，结果报告如下。

    病人一般情况

    男5例，女6例，年龄在1-53岁之间，平均年龄30岁。9例为初诊患者，2例继发于慢性粒细胞白血病。临床表现发热、乏力、出血、腹痛和腹胀，外周血检查以全血细胞减少和贫血为主；病理检查显示5例患者继发骨髓纤维化。所有患者经形态、病理、细胞组织化学、染色体、细胞流式仪或免疫组织化学检查，确诊为M7（表1）。

    电子显微镜标本制备

    常规透射电子显微镜和PPO组织化学标本制备按文献［3］完成。部分骨髓有核细胞加入血小板过氧化物酶孵育液（0.05 mol／L Tris缓冲液，pH 7.6； 1 ml加3,3二氨基联苯胺2 mg、3％ H2O2 20 μm），37℃避光振荡孵育90分钟；其它细胞用2.5％戊二醛4℃固定2小时，用于透射电镜观察。包埋、超薄切片按常规进行，常规用铅铀染色，PPO组织化学标本不染色。

    电子显微镜观察

    先观察PPO标本，计数PPO阳性细胞占有核细胞的百分比，测定阳性细胞直径。细胞大小用一个网眼内细胞最大和最小直径表示，最大和最小直径大于5 μm为大小不均。根据组织化学对比观察常规标本中巨核细胞结构，表面无或偶见伪足和突起用"－"表示，"+"为1/3细胞以下有伪足，"++"为1/3到半数以内可见突起，"+++"表示半数以上细胞有伪足。核质比用同一网眼中巨核细胞核与胞体直径比表示。同网眼中半数以上细胞核为圆形，刻痕和切迹深度小于最长直径1/8，为核轻度不规则，用"+"表示；折叠或切迹深度大于最长直径1/8而小于1/4，为中度不规则，用"++"表示；细胞核扭曲、多极，大于最大直径1/4，或长短直径比大于2，为极度不规则，用"+++"表示。细胞不含分界膜或管道结构为"－"，1/3以下细胞有为"＋"，1/3到2/3之间为"++"，2/3以上为"+++"，致密颗粒多少评定方法相同。

    结    果

    超微结构观察显示不仅不同患者幼稚巨核细胞数量和细胞器结构分化发育差别显著，而且同一患者骨髓内巨核细胞PPO阳性率和阳性强度也存在差别，部分细胞阳性明显，部分为阴性或弱阳性（表2）。

    所有病例骨髓内可见分化程度不同幼稚巨核细胞，成熟巨核细胞少见，幼稚细胞形态不一，管道系统幼稚简单，无明显分布规律，分界膜内无血小板，α颗粒少或电子密度低，11例中7例患者巨核细胞体积小，直径在20 μm以内，外形规则，大小均匀，表面突起少，7例中2例（病例1、4）细胞PPO阳性率在50%以上，外观似淋巴细胞，直径在10-15 μm之间，核轻度不规则，核质比大，异染色质多，核仁小，多数细胞有细小颗粒，大部分无α颗粒，其它细胞器少；少数细胞含典型α颗粒，分界膜细小、狭窄，或呈囊腔样结构，散在分布，有时难以与未成熟高尔基体鉴别，胞浆含粗细一致的管道结构，排列无规律（图1A，B，C）。另外5例患者（病例5、6、7、8、10）PPO阳性率在8%-22%之间，巨核细胞直径20 μm左右，外观似原始或幼稚单核细胞，核为圆形、马蹄形或胎儿形，核质比例比前2例低，异染色质多少不等，核仁明显，这5例中3例（病例6、7、10）无分界膜和致密颗粒，2例（病例5、8）偶见不成熟分界膜和小致蜜颗粒（图2A，B）。

    11例中4例患者（病例2、3、9、11）骨髓巨核细胞大小不等，胞浆量与细胞大小相关，核质比高低不一，PPO阳性率在16%-80%之间，小细胞阳性多，大细胞阳性少。直径20 μm以内细胞形态结构和上述7例相似；直径20 μm以上细胞表面有大量不规则突起或伪足，核极度不规则，呈马蹄形、胎儿形、多极、多个或多叶，异染色质丰富，核仁明显，胞浆丰富，部分细胞可见局灶性迷路样折叠的分界膜，间隙宽大，结构较成熟，表面有时可见管道结构，除质地均匀的致密颗粒外，部分颗粒有明显高密度和低密度区，为成熟的牛眼样α颗粒。2例（病例9，11）部分骨髓巨核细胞直径达40 μm，发育程度不等（图2C）。

    讨    论

    白血病性巨核细胞的形态变化最大,光学显微镜下描述为"异常细胞"、"不明细胞"、"单核样细胞"、"淋巴样巨核细胞"及"小巨核细胞"。电子显微镜观察根据分界膜、管道结构、α颗粒、核内有丝分裂，以及细胞大小、染色质、血小板形成情况把正常巨核细胞分为4个发育阶段。Ⅰ期巨核细胞直径在6-24 μm之间，核质比大，核规则，异染色质较少，有核

     仁，无核内有丝分裂，核糖体丰富，α颗粒，Golgi体少，分界膜开始发育，所占空间小，这个阶段属于原始阶段；Ⅱ期细胞直径在14-30 μm之间，核内有丝分裂开始，核为分叶状，胞浆增多，有未成熟α颗粒和局灶性分界膜，属于幼稚阶段细胞；Ⅲ、Ⅳ期细胞核内有丝分裂加强，直径在40-60 μm之间，胞浆高度发育，核质比小，出现成熟α颗粒和大面积分界膜结构，Ⅳ期细胞周边出现微管和微丝环状结构，可见细胞器较少的周边空白区，分界膜系统进一步成熟脱落，形成血小板［4］。

    本组11例患者的巨核细胞大都属于Ⅰ期，多数细胞直径在20 μm以内，有微管、膜性囊腔及微小致密颗粒，缺乏成熟阶段应有的α颗粒、分界膜系统、胞膜下环状微丝微管以及无结构胞浆区，显示M7以幼稚和低分化细胞为主的特点。这些小细胞又分两种类型，一种直径在10-15 μm之间，外形规则，异染色质多，胞浆稀少，光学显微镜下属于淋巴样巨核细胞［5］，但电子显微镜下可以看到清晰的管道和膜性囊腔及致密小颗粒，核膜PPO阳性率高；另一类体积稍大，直径在15-20 μm之间，表面突起稍多，胞浆丰富，异染色质较少，核仁显著，光学显微镜下形态似原始或幼稚单核细胞［6］，但电子显微镜下膜性囊腔、致密颗粒及微管较少，部分病例的巨核细胞PPO为阴性。这两种小巨核细胞可以一种为主出现于白血病患者骨髓，本组2例患者以"淋巴样"小巨核为主，5例患者以"单核样"为主。文献报道2种小巨核细胞同时存在时可能伴t(1;9)(p32;q34)易位［7］。

    4例患者除含以上2种小巨核细胞外，同时可见直径在30-40 μm 之间的大巨核细胞，这些细胞胞浆多，PPO反应有时阴性，细胞核极不规则，呈多极、多叶或多个核，异染色质多；胞浆含致密颗粒，有时可见密度高低不等的α颗粒；此外可见迷路样分界膜，间隙宽大，偶见管道结构。但这些细胞的分界膜系统所占的面积小，α颗粒数量少，没有胞膜下典型环状微丝微管结构和无结构区，说明这些细胞的细胞器存在不对称或不同步分化，尚未完全成熟，属于Ⅱ或Ⅲ期。这4例患者除包含细胞外，有少数细胞外形规则，直径在12-15 μm之间，核圆，异染色质少，核仁明显，胞浆无可分辩的标志结构，有弥散的糖原颗粒和核糖体，PPO阴性或弱阳性，这些细胞难以定性，很可能是真正意义上未分化的原始巨核细胞或巨核祖细胞。

    总之，大部分M7患者未成熟巨核细胞处于Ⅰ期分化阶段，含细小致密颗粒、膜性囊腔和散在管道结构，分界膜结构、微管和α颗粒发育不完全，PPO反应强度不等，有阴性细胞。少数患者同时含Ⅱ、Ⅲ期细胞，可见局灶性分界膜系统和典型α颗粒。不同M7患者巨核细胞结构分化和PPO反应强度存在差别，说明M7细胞存在明显异质性，有必要进一步深入研究。

【参考文献】1Peterson BA, Levine EG. Uncommon subtypes of acute nonlymphocytic leukemia: clinical features and management of FAB M5, M6 and M7. Semin Oncol, 1987; 14: 425-434

2江波澄,熊树民,徐雅萍等. 5例巨核细胞白血病的临床及实验室观察. 山西临床医药杂志,2001;10:151-152

3刘津华， 齐淑玲， 仲舒等. 血小板过氧化物酶影响因素及超微结构定位. 中华血液学杂志, 2003;24:385

4Greer JP, Foerster J, John N, et al. Wintrobe's Clinical Hematology (11th edtion). 山东:山东科技出版社, 2004: 108

5刘抗援, 杨科, 何学鹏等. 急性巨核细胞白血病的实验室观察. 临床检验杂志, 1998；16：364-365

6张力, 区小冰, 俞一平. 小儿急性巨核细胞白血病的诊断. 临床血液学杂志, 2002; 15:231-232

7Hasegawa D, Sano K, Kosaka Y, et al. Acute megakaryoblastic leukemia in an infant with a novel t(1;9)(p32;q34). Cancer Genet Cytogenet, 2000; 122:59-62