βcatenin在慢性粒细胞白血病中的表达及与bcr/abl的关系

作者：李增军,邱录贵,李新,麦玉洁,王国蓉,于珍,王亚非,李长虹,李茜    作者单位：实验血液学国家重点实验室，天津 300020

【摘要】  本研究检测βcatenin 在慢性粒细胞白血病（CML）各期中的表达情况，并与bcr/abl的表达变化相比较，为进一步探讨βcatenin在CML急性变中的意义提供依据。首先分离CML各期患者及正常供者骨髓单个核细胞（BMMNC），提取总RNA，逆转录为cDNA，用实时定量PCR的方法检测βcatenin的表达情况，同时检测部分标本bcr/abl的表达情况，分析二者在CML进展过程中的表达变化及两者的相关性。结果表明：βcatenin在CML急性变期BMMNC的表达明显高于慢性粒细胞白血病（CML）慢性期（p＜0.001 ）、加速期（p=0.016）及正常人（p=0.004），而在后三者之间未见统计学差异。急性变期bcr/abl的表达明显高于慢性期（p=0.001）。βcatenin的表达量与bcr/abl表达水平有明显的相关性（r=0.620, p＜0.001）。结论：CML急性变期βcatenin的表达明显升高，并与bcr/abl的表达量有相关性。βcatenin的表达增高可能与CML急性变有关。

【关键词】  慢性粒细胞白血病

    Expression of βCatenin Gene in CML and Its Relationship with bcr/abl

    LI ZengJun, QIU LuGui， LI Xin, MAI YuJie, WANG GuoRong, YU Zhen, WANG YaFei,

    LI ChangHong, LI Qian

    State Key Laboratory of Experimental Hematology, Institute of Hematology, Blood Disease Hospital,  Peking Union Medical College, Chinese Academy of Medical Sciences,   Tianjin 300020, China

    Abstract    This study was aimed to quantitatively detect the expression level of βcatenin and bcr/abl in different phases of chronic myeloid leukemia  (CML)  and to analyze their potential relationship and significance in the progression of CML． First, the total RNA isolated from BMMNC of patients with CML and donors was reversely transcribed into cDNA．The realtime quantitative PCR method was used to analyze the expression level of βcatenin and bcr/abl．The expression level of   βcatenin  and bcr/abl in different phases of CML was compared and the correlation was analyzed between the two genes. The results showed that the  βcatenin gene in  BMMNC of blast crisis of CML patients was expressed significantly higher than that  in chronic phase（p＜0.001 ） and accelerated phase （p=0.016）of CML patients and in normal donors（p=0.004）. The expression of bcr/abl in blast crisis of CML was statistically higher than that in chronic phase  of CML（p=0.001）. The expression levels of βcatenin and bcr/abl were correlated with each other in CML patients（r=0.620, p＜0.001）. It is concluded that the  βcatenin gene  in blast crisis of CML patients  express  higher than that in chronic phase and accelerated phase of CML, and its expression level is correlated with the level of bcr/abl expression.  The increased expression of βcatenin may be account partly for the blast crisis of CML.

    Key words    CML; blast crisis； bcr/abl gene; βcatenin；expression

    J Exp Hematol 2007; 15(5):931-935

    WNT/βcatenin信号传导途径是参与胚胎发育及肿瘤形成的重要信号传导途径［1,2］，同时与造血系统发育、造血干细胞自我更新及某些恶性血液病密切相关［3-5］，βcatenin是该途径中的关键环节，因此近年来倍受重视。最近Jamieson等［6］的研究提示，βcatenin分子在慢性粒细胞白血病（CML）急性变期的粒细胞-巨噬细胞、祖细胞中表达明显增高,并赋予后者异常增强的增殖能力和集落形成能力，它可能是CML急性变的重要机制。然而，βcatenin转录水平的研究目前还很少，本研究应用实时定量PCR的方法，从mRNA水平研究了βcatenin在 CML 各期中表达的差别，同时将βcatenin 与 CML特征性的融合基因bcr/abl的表达进行相关性分析，为进一步阐明CML急性变的机制提供新的探索。

   病例资料

    所有病例均来自中国医学科学院血液病医院门诊及住院患者，经骨髓细胞形态、细胞遗传学及染色体检查，符合慢性粒细胞白血病各期的诊断标准。所有慢性期患者均为初诊患者、急性变期及加速期患者病情进展后未经治疗或虽经治疗未获缓解的患者。在检测标本中，慢性期 34例，加速期4 例，急性变期10例，其中男31例，女17例，中位年龄42(23-71)岁。正常对照9例，均为造血干细胞移植的健康供者。

    试剂和仪器

    SYBR Premix Ex Taq试剂盒为TaKaRa公司产品，淋巴细胞分离液（Ficoll）购自灏洋生物公司， TRIzoL   reagent和MMLV逆转录试剂盒均为美国Invitrogen公司产品。96孔反应板及光学管（Optical Tubes）和 Prism Real Time 7500 PCR扩增仪 为美国Applied Biosystems公司（ABI）产品。

    骨髓单个核细胞的分离、RNA提取和逆转录

    骨髓单个核细胞的分离  CML患者或正常供者骨髓1-5 ml,肝素抗凝,经FicollHypaque密度梯度离心分离单个核细胞（MNC），计数，洗涤后-80℃贮存备用。

    提取总RNA的逆转录   (0.5-1)×107骨髓MNC，加入TRIzoL reagent 1 ml，充分混匀，加入0.2 ml氯仿，离心取上清；加入0.5 ml异丙醇沉淀RNA ,75%乙醇洗涤,干燥并DEPC水溶解，紫外分光光度测定RNA浓度及鉴定纯度，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA质量。

    逆转录  采用40 μl体系，含RNA 2 μg，Oligo dT 1 μg，dNTP （10×）2　μl，DTT 4　μl（10 mmol/L），RNasin　20　U和MMLV 200　U(均为Invitrogen公司产品)，按照说明书进行，所得cDNA于-20℃保存备用。

    实时定量PCR和分析

    采用实时定量PCR SYBR Green I检测法。每份标本设3个平行对照反应孔。以GAPDH作为内参照，βcatenin，bcr/abl作为目的基因。

    引物设计  设计引物序列为:GAPDH：上游：5′G AAGGTGAAGGTCGGAGTC3′下游： 5′GAAGAT GGTGATGGGATTTC3′，扩增片段 226 bp；βcatenin：上游：5′GTGTGGCGACATATGCAGCT3′，下游：5′CAAGATCAGCAGTCTCATTC3′  扩增片段141 bp；bcr/abl（b2a2）：上游：5′ATCCGTGGAGCT GCAGATG3′，下游：5′TTCCAACGAGCGGCTTC ACT3′，扩增片段 150 bp。

    反应体系  采用25 μl体系，含SYBR Premix Ex Taq （2×）12.5 μl,PCR 上下游引物（10　μmol/L）各0.5　μl，ROX Reference Dye(50×)0.5　μl,cDNA 2　μl, 灭菌去离子水9　μl。

    PCR扩增  95℃预变性10秒，扩增循环95℃ 5秒，62℃ 34秒，共40个循环。熔解程序：95℃ 15秒，60℃ 60秒，95℃ 15秒。

    CT值测定  cDNA模板倍比稀释，测定不同浓度目的基因与内参扩增后的CT值，确定CT值与cDNA 浓度的关系，以保证CT值可以反映扩增基因的浓度。通过熔解曲线确定PCR产物的特异性。

    分析方法  采用 2-ddCT 法。该法是实时定量PCR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法［13］。数据分析时用-ddCT代表基因的相对表达量（RQ=2-ddCT），CT 代表扩增产物达到设定阈值所经历的循环数，dCT=目的基因CT值-内参基因CT值，ddCT=待测样本dCT-标准dCT。

    统计学处理

    以-ddCT值作为反应基因表达丰度的指标，各组间的比较采用SPSS统计软件包中非参统计中MannWhitney检验 ,或OneWay ANOVA（即成组设计的方差分析）中LSD检验，或成组设计的T检验（双侧T检验）, p<0.05认为有统计学差异。相关性分析采用Bivariate线性相关分析。

    结    果

    RNA 纯度和质量分析

    所提取总RNA 经紫外分光光度计检测，比值在1.8-2.0之间，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，28S、18S条带清晰可见，无明显降解。

    方法的可靠性和扩增的特异性

    同一标本cDNA经倍比稀释后，分别对内参基因和目的基因进行扩增，结果显示相邻浓度CT值相差1左右，说明其CT值可以反应扩增基因的丰度。扩增后进入熔解程序生成熔解曲线，熔解曲线显示锐利的单一峰，无其它非特异峰，这说明扩增产物均一，无非特异扩增及引物二聚体（图1）。琼脂糖凝胶电泳进一步验证扩增片段的均一性及长度。

    βcatenin在正常人及CML各期的表达

    βcatenin在正常人及CML各期均有较强程度的表达，提示该基因在正常骨髓细胞中就有表达，参与细胞的生理功能。但正常人骨髓单个核细胞的检测显示,βcatenin的相对表达量变化很大，不呈正态分布，这可能部分与样本量太小有关。采用非参统计中MannWhitney方法分析表明，正常供者骨髓MNC中βcatenin的表达与CML慢性期（p=0.649）和加速期（p=0.825）表达无明显差异，但明显低于急性变期表达（p=0.004）（图2）。

    Figure 2.   Relative expression level of βcatenin in various groups. Note: CPchronic phase; APaccelerated phase;BC- blast crisis;(-ddCT represents the mRNA level; error bar shows the 95% confidence interval).

    CML各期βcatenin表达量的差别

    采用OneWay ANOVA（即成组设计的方差分析）中LSD检验，方差齐性检验符合方差齐的条件，发现各组间有显著统计学差异（p=0.001）。进一步两两分析表明，CML急性变期βcatenin的表达比慢性期（p＜0.001 ）和加速期（p=0.016）均明显升高，而加速期与慢性期之间则无差异（p=0.864）（图2,表1）。

    CML慢性期与急性变期bcr/abl表达的差别

    对19例CML慢性期和6例急性变期的标本同时检测了bcr/abl的表达水平。结果显示，bcr/abl在CML慢性期与急性变期表达水平有显著差异（成组设计t检验， p<0.001），与文献报道一致，提示在CML急性变期伴随着bcr/abl的明显扩增（图3，表2）。

    βcatenin与bcr/abl表达的相关性分析

    对同时进行βcatenin和bcr/abl检测的25例CML(19例慢性期，6例急性变期)的分析表明，βcatenin和bcr/abl在CML急性变期表达较慢性期均明显增高，相关性分析表明： βcatenin与bcr/abl的表达有相关性（r=0.620，p<0.001 ） （ 图4）。

    Figure 4.   Correlation of βcatenin and bcr/abl in mRNA level.   (r=0.620，p<0.001 ）.讨    论

    慢性粒细胞白血病(CML)急性变是大多数CML患者的转归，目前尚无有效方法治疗。因此探讨CML急性变的机制是预防CML急性变及探讨有效治疗的前提，同时也有利于揭示某些急性白血病的发病机制。

    已经证明,WNT/βcatenin信号传导途径的异常在结/直肠癌、肺癌、乳腺癌等多种实体瘤及多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性白血病等恶性血液病的发生发展中有明确促进作用［2,5,7-12］，其中βcatenin分子在胞浆中的异常积累是关键环节，而蛋白水平的增高涉及到合成的增多与降解的减少，WNT途径主要在蛋白降解水平上对βcatenin进行调解，对于βcatenin转录水平的研究国内外至今报道较少。而对于βcatenin在CML发生发展中的研究国内外报道更少，尤其在mRNA水平上研究报道极少。Serinso等［11］对石蜡保存的骨髓活检标本细胞进行定量 RTPCR分析发现，AML患者βcatenin的表达明显高于CML，但该研究中CML均处于慢性期（11例），无急性变期及加速期患者。最近Jamicson等［6］研究表明，βcatenin在CML的急性变期表达明显增高，这提示βcatenin有可能在CML急性变的过程中作为肿瘤发病中的“二次事件”发挥着重要作用［14］，但他并没有研究βcatenin mRNA水平的表达变化。

    我们应用实时定量PCR的方法，研究了不同阶段CML患者骨髓单个核细胞中βcatenin的表达情况。研究发现，急性变期βcatenin的mRNA水平明显高于慢性期、加速期及正常供者，而慢性期及加速期的结果与正常供者无明显差异。这证实βcatenin在CML急性变期转录水平上调，至少可能是其蛋白水平增高的部分原因，这为进一步研究βcatenin表达的调节，揭示βcatenin在CML急性变中的作用提供了理论基础。另外，在加速期βcatenin的表达有无升高尚存争议，本组的资料显示，该期与慢性期之间βcatenin的表达无差异，而与急性变期表达明显不同，但该组样本数较小（加速期仅4例），尚需进一步加大样本量研究证实。

    bcr/abl融合基因的产生是CML发病的根本原因，该基因在CML急性变期的表达增高［15］，是CML急性变的特征之一，但单纯这种量的改变显然不是CML急性变的全部机制，合并其它的染色体异常或基因改变可能是其潜在的原因。与急性变相关的异常基因已经有较多研究，如p53的不稳定性, SOCS2、WT1的异常等［16-18］，但目前尚无定论。考虑到βcatenin在多种肿瘤发病及造血系统发育和造血干细胞自我更新中的作用，结合我们检测到βcatenin表达水平的明显升高，我们有理由认为βcatenin的异常高表达或许就是CML急性变的重要机制之一。在本研究中我们同时对部分病例用实时定量PCR检测了bcr/abl的表达，发现在急性变期表达明显升高，与以前报道相符［15］。我们对βcatenin及bcr/abl的表达量进行了相关分析发现，二者之间存在一定的相关性，这在以前尚未见报道。这提示βcatenin与bcr/abl可能在CML急性变中起协同作用，共同参与急性变。有文献报道，正常细胞中的bcr分子可以与βcatenin结合，对后者的基因转录功能产生负调节作用，而bcr/abl融合蛋白则失去该负性调节作用［19］。当然，这也可能仅仅是一种伴随现象，分别独立的发挥作用。

    βcatenin不仅与某些癌基因的转录有关，还是一种重要的细胞间黏附分子，与钙粘蛋白结合参与细胞的黏附功能。是在胞膜参与黏附还是进入胞核参与基因转录，βcatenin的这一选择对决定细胞命运起重要作用，尤其在CML中，黏附功能的缺陷也是其重要的发病机制之一［20］。有研究显示，bcr/abl融合蛋白本身即可参与βcatenin定位的选择，如ABL具有的酪氨酸激酶活性可使βcatenin更易于从黏附复合体解离而进入细胞核发挥转录功能［21］,显然bcr/abl融合蛋白的这一作用可能会更强。因此βcatenin水平的增高在慢粒细胞中更有可能参与转录功能而不是黏附功能，我们初步检测了E型钙黏蛋白的表达，结果发现其在CML及正常人骨髓单个核细胞中基本不表达，这也提示βcatenin在骨髓细胞中主要参与转录功能。

    CML急性变是一个复杂的过程，可能涉及到多种信号传导途径多种成分的异常，研究CML急性变机制，是研究肿瘤发病机制的最佳模型之一。βcatenin作为造血调控及多种肿瘤发生中的重要调节因素，尤其与bcr和abl的异常均有关,研究其在CML发病及急性变中的作用，有利于进一步阐明CML急性变的机制，为进一步防治急性变提供理论基础。同时针对WNT/βcatenin信号传导途径的治疗有可能成为CML治疗的新靶点，从而为CML急性变的治疗提供新的思路。

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