cmpl在真性红细胞增多症患者骨髓CD34阳性细胞及血小板上的表达

作者：白洁， 邵宗鸿， 施均， 贾海蓉， 孙娟    作者单位：中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所、血液病医院，天津 300020

【摘要】  本研究了解真性红细胞增多症(PV)患者血小板膜及骨髓CD34阳性细胞表面TPO受体（cmpl）蛋白及骨髓造血细胞cmpl mRNA表达情况。应用双色流式细胞术检测13例PV患者及15名正常对照者骨髓CD34阳性细胞表面cmpl蛋白表达；应用单色流式细胞术检测15例PV患者及15名正常对照者血小板表面cmpl蛋白表达；应用RTPCR方法检查PV患者及正常对照者骨髓造血细胞cmpl mRNA的表达情况。结果表明： CD34阳性细胞cmpl蛋白表达在PV患者为0.99％±0.14％，与正常对照（0.92％±0.12％）相比无差别（p>0.05）；血小板cmpl蛋白表达在PV患者为20.33％±4.84％，与正常对照（23.50％±3.64％）相比无差别（p>0.05）；骨髓造血细胞cmpl mRNA与正常组相比也无明显差别（p>0.05。） 结论： PV患者骨髓CD34阳性细胞、血小板膜cmpl蛋白及骨髓造血细胞cmpl的mRNA表达无明显异常。

【关键词】  真性红细胞增多症

    Expressions of cmpl Proteins on CD34+ Bone Marrow Cells and Platelets of the Patients with Polycythemia Vera

    BAI Jie, SHAO ZongHong1,  SHI Jun,  JIA HaiRong, SUN Juan

    Institute of Hematology and Blood Disease Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences  Peking Union Medical College,  300020 Tianjin, China; 1Department of Hematology, General Hospital, Tianjin Medical University, 300070 Tianjin, China

    Abstract    The objective of this study was to investigate the expressions of TPO receptor (cmpl) proteins on CD34 positive  bone marrow cells (CD34+ BMCs),  platelets   and  the expression of cmpl mRNA in bone marrow cells of the patients with polycythemia vera (PV). The expressions of cmpl proteins on CD34+ bone marrow hematopoietic cells  of 13 PV patients  and 15 normal controls were assessed by bicolor flow cytometry  and the expressions of cmpl proteins on platelets of 15 PV patients and 15 normal controls were assessed by monocolor flow cytometry, and the expressions of cmpl mRNA in bone marrow hematopoietic cells (BMHCs)  were assessed by RTPCR.  The results showed that no difference was found between the expression of cmpl proteins on CD34+  BMHCs   of PV patients（0.99％±0.14％） and that of normal controls （0.92％±0.12％）（p>0.05）. There was no difference too between the expression of cmpl protein on platelets in PV patients（20.33％±4.84％） and that in normal controls （23.50％±3.64％）（p>0.05）.  No difference between the expression of cmpl mRNA in BMHCs  of PV patients and that in normal controls  was seen. In conclusion, the expressions of cmpl proteins on CD34+ BMHCs,   platelets  and  cmpl mRNA in BMHCs of PV patients were not obviously abnormal.

    Key words    polycythemia vera;  platelet; bone marrow hematopoietic cell; CD34 positive;  cmpl

    J Exp Hematol 2007; 15(5):1061-1064

    真性红细胞增多症（PV）属骨髓性增殖性疾病（MPD），是由多潜能造血干祖细胞发生突变而引起的，其造血干祖细胞存在高增殖性及低凋亡性［1，2］。近年来的大量研究证实，PV造血祖细胞对多种细胞因子高度敏感［3-5］，说明其造血细胞表面细胞因子受体或其信号传导系统可能存在异常，因此其造血干祖细胞表面细胞因子受体及PV信号传导系统的研究有助于对其发病机制的了解。

    PV患者红系祖细胞在不加外源性EPO时可以形成内源性红细胞集落（EEC）［6-8］，但多项研究证明PV患者EPO受体及EPO与配体的亲和能力是正常的，未发现EPO受体基因的异常［9］。血小板生成素（TPO）是调节血小板生成的细胞因子，其构 型上有一个153个氨基酸的结构域与EPO相似。在体外TPO不但对巨核前体细胞而且对造血祖细胞的增殖分化均产生直接作用［10，11］。中国实验血液学杂志  J Exp Hematol 2007; 15(5)cmpl在真性红细胞增多症患者骨髓CD34阳性细胞及血小板上的表达我们应用流式细胞术检测了15例PV患者及15名正常对照者血小板表面TPO受体（cmpl）。应用RTPCR方法检查PV患者及对照骨髓造血细胞cmpl mRNA表达情况，以阐明cmpl在PV发病机制中的意义。现将结果报道如下。

    材料和方法

    检测对象

    2002年1月至2003年10月在中国医学科学院血液病医院诊治的PV患者15例，正常对照15名。全部患者的诊断及疗效判定依据国内统一标准［12］。15例PV患者中11例为初诊未治疗患者，2例单纯放血治疗，2例应用羟基脲／干扰素治疗，平均治疗时间为7个月，停药2周以上且血象仍高于正常。15名正常对照，男9例，女6例，中位年龄47。15例PV患者的临床和检验指标见表1。

    试剂

    淋巴细胞分离液FacollPaque(1.077 g/ml)由中国医学科学院血液学研究所生产；兔抗人cmpl单克隆抗体由日本麒麟公司馈赠。FITC标记羊抗兔IgG购自美国Southern Biotech公司；PE标记的CD34、IgG1抗体试剂盒购自美国Becton Dickinson公司。RNA提取试剂（TRIZOLTM reagent）由Gibco公司生产；Taq plus聚合酶、cmpl引物，参照文献［6］设计，由上海生物工程有限公司合成；紫外分光光度计由美国Shimadzu公司生产；PCR扩增仪由美国FECETUS公司生产；紫外照相机购自日本Olympus公司；流式细胞仪(FACS) 由美国Becton Dickinson公司生产。

    骨髓CD34阳性细胞表面cmpl表达的检测

    取肝素抗凝新鲜骨髓200 μl，将人AB型血清加入新鲜骨髓，孵育5分钟，封闭非特异抗体。加入兔抗人cmpl IgG, 4℃避光孵育30分钟。用含0.5% BSA及0.6%柠檬酸钠的PBS液洗涤2遍，FITC标记的羊抗兔IgG，4℃避光孵育30分钟。加入PE标记的CD34单克隆抗体，避光4℃孵育45分钟。加入10％溶血素孵育10分钟，弃除溶血素，应用PBS洗涤2遍，加1％的多聚甲醛固定，24小时内应用流式细胞仪检测。1×106骨髓细胞加入FITC/PE标记的同型特异抗体同时孵育作为阴性对照。

    血小板表面cmpl表达的检测

    取3.8%的柠檬酸钠抗凝的新鲜静脉血5 ml，以1 600×g离心10分钟，吸取取富含血小板的血浆，再以7 500×g离心12分钟，将待测血小板用含0.5% BSA及0.6%柠檬酸钠的PBS液洗涤2遍。取1×109血小板，再用含0.5% BSA及0.6%柠檬酸钠的PBS液洗涤2遍，1小时内应用流式细胞仪检测。

    cmpl表达的RTPCR法检测

    取（5-10）×106骨髓单个核细胞，应用TRIZOL一步法抽提取总RNA后应用紫外分光光度计测定其浓度和纯度。Cmpl引物序列如下： cmpl上游引物 5'CCTACTGCTGCTAAAGTGGCAAT3'； 下游引物 5'CAATAGCTTAGTGGTAGGTAGGA 3'。

    PCR体系50 μl，含待测DNA 2 μl， 2.5 mmol/LdNTP 1 μl, Taq plus聚合酶2.5 U，10×缓冲液5 μl, 10 mmol/μl上游引物及下游引物各2.5 μl，加无菌双蒸水至50 μl。使用PCR扩增仪（FECETUS公司）扩增。Cmpl的PCR条件参考文献［13］为： 94℃预变性7分钟，94℃变性45秒，52℃退火45秒，72℃延伸45秒，72℃再延伸5分钟，共35个循环。取10 μl扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，电压10 V/cm。应用紫外照相机（日本Olympus公司）记录结果。PCR的扩增长度应为548 bp(βactin)、368 bp(cmpl)。

    统计学方法

    率的比较采用Pearson 卡方检验或Fisher精确概率法分析；均数比较采用t检验；皆用SPSS软件处理。

    结    果

    骨髓CD34阳性细胞表面cmpl表达

    骨髓CD34阳性细胞表面cmpl表达在PV患者为0.99％±0.14％，与正常对照（0.92％±0.12％）相比无差别（p>0.05）(表2）。

    血小板表面cmpl表达

    血小板表面cmpl蛋白表达在PV患者为20.33％±4.84％，与正常对照（23.50％±3.64％）相比无差别（p>0.05）（表2）。

    cmpl mRNA表达

    骨髓造血细胞cmpl mRNA 在PV患者检出率为46.7%(7/15)与正常组40%(6/15)比较无明显差别（附图）。

　　讨    论

    近年来人们重视到PV患者巨核细胞集落（CFUMK）对TPO高度敏感。即PV的造血干、祖细胞（CD34+细胞）在没有TPO条件下能够形成CFUMK。因此人们认为TPO介导的信号传导系统异常可能与PV发病有关［14］。

    有人报道敲除小鼠TPO受体（cmpl）时，多潜能造血干细胞和髓系、红系定向祖细胞数均减少。若小鼠cmpl过度表达，可导致过度造血和骨髓纤维化。cmpl异位表达可引起致命的红细胞增多症。应用带有截短的cmpl基因的髓系增殖性白血病病毒(MPLV)可诱导大鼠红细胞、血小板、粒细胞增多及脾大。在体外用MPLV转染造血细胞，可使造血祖细胞不依赖于生长因子而形成红细胞集落［15］。缺乏EPO受体的胚胎中，TPO可使红细胞集落形成［6］，且可以阻止去EPO受体的红系祖细胞凋亡［16］。

    Dai等［3，4］报道，34名PV患者血小板均缺失cmpl，缺失cmpl血小板与TPO共孵育，不能激活JAK2/TYK2，以至于STAT5不能进行酪氨酸磷酸化。他们应用C末端mpl抗血清证明了PV患者中cmpl翻译后加工过程受损。mpl胞浆外结构域第4位点缺乏翻译后糖化修饰，并认为这与其细胞内高尔基器运输缺陷有关。

    Muta等［5］应用免疫杂交方法得出了不同的结论。他们发现，15名PV患者中有8名cmpl表达水平减低，而7名表达正常。他们认为cmpl表达水平及其功能完整性在PV患者存在异质性。

    在本研究中我们发现，CD34阳性细胞、血小板表面cmpl蛋白表达及骨髓造血细胞cmpl mRNA表达在PV患者与正常对照者中均无差别。这表明PV患者高增殖和低淍亡与cmpl无关，可能与细胞因子信号传导系统共同通路有关。

【参考文献】1白洁， 邵宗鸿， 刘鸿等. 真性红细胞增多症患者骨髓CD34阳性细胞淍亡及增殖特征研究. 中华血液学杂志，2004；25：195-197

2白洁， 邵宗鸿， 刘鸿等. 真性红细胞增多症患者骨髓CD34阳性细胞凋亡相关蛋白的表达. 中华血液学杂志，2004；25：617-620

3Dai CH, Krantza SB, Green WF, et al. Polycythemia vera Ⅲ. Burstforming usintserythroid(BFU-E) response to stem cell factor and ckit receptor expression. Br J Haematol, 1994; 86: 12-21

4Coorrea PN, Eskinazi D, Axelrad AA, et al. Circulating erythroid progenitors in polycythemia vera are hypersebsitive to insulinlike growth factor in vitro: studies in an improved serumfree medium. Blood, 1994; 83: 99-112

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7Bai J, Shao ZH, Liu H, et al. Endogenous erythroid colony assay in patients with polycythemia vera and its clinical significance. Chin Med J(Engl), 2004; 117 :668-672

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9LeCouedic JP, Mitjavila MT, Villeval JL, et al. Missense mutation of the erythropoietin receptor is a rare event in human erythroid malignancies. Blood, 1996; 87:1502-1511

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11Ratajczak MZ, Ratajczak J, Marlicz W, et al. Recombinant human thrombopoietin( TPO ) stimulates erythropoiesis by inhibiting erythroid progenitor cell apoptosis. Br J Haematol, 1997;98: 8-17

12张之南，沈悌. 血液病诊断及疗效标准. 北京：科学出版社， 1998. 141

13Xie X, Chan RJ, Johnson SA, et al. Thrombopoietin promotes mixed lineage and megakaryocytic colonyforming cell growth but inhibits primitive and definitive erythropoiesis in cells isolated from early murine yolk sacs. Blood, 2003; 101: 1329-1335

14DAMON A, HOLUB DA. Host factors in polycythemia vera. Ann Intern Med, 1958; 49:43-60

15Caldwell GG, Kelly DB, Heath CW, et al. Polycythemia vera among participants of a nuclear weapons test. JAMA, 1984; 252: 662-664

16Kralovics R, Indrak K, Stopka T, et al. Two new EPO receptor mutations: truncated EPO receptors are most frequently associated with primary familial and congenital polycythemias. Blood, 1997; 90: 2057-2061