苯甲醇对红细胞冻干前海藻糖负载红细胞影响研究

作者：陈燕,陆志刚    作者单位：兰州军区兰州总医院血液科，兰州 730050

【摘要】  为研究苯甲醇对海藻糖负载红细胞的影响，在4℃条件下将红细胞孵育在浓度分别为10、30、50、100 mmol/L的苯甲醇海藻糖溶液中24小时，用氰化血红蛋白试剂盒测定海藻糖负载红细胞的溶血率，用硫酸蒽酮法检测红细胞内海藻糖浓度水平。结果表明：在100 mmol/L苯甲醇海藻糖溶液组，其红细胞内海藻糖浓度为72±12.98 mmol/L，与其它各组相比，有显著统计学差异（p=0.000）；溶血率为17.99±3.75%，与其它各组相比，有显著统计学差异（p=0.000）。结论：苯甲醇可提高海藻糖负载红细胞的负载率，随着苯甲醇浓度的升高红细胞海藻糖负载率也提高，100 mmol/L的苯甲醇浓度为可用浓度。

【关键词】  苯甲醇

    Effect of Benzyl Alcohol on Trehaloseloading Red Blood Cells before Lyophilization

    CHEN Yan, LU Zhi Gang1

    Department of Hematology, Lanzhou General Hospital, Lanzhou Military Area  of  PLA, Lanzhou 730050, China; 1Department of Blood Transfusion, Zhujiang Hospital, The Southern Medical University, Guangzhou  510282 China

    Abstract    This study was aimed to evaluate the effect of benzyl  alcohol on  trehaloseloading red blood cells (RBCs). The RBCs were incubated in 10, 30, 50 and 100 mmol/L concentrations of benzyl alcoholtrehaloe solution at 4℃ for 24 hours. The hemolysis rate of loaded RBCs was detected by using cyanohemoglobin kit,  the intracellular trehalose level were assayed by sulfate anthrone method. The results showed that the intracellular trehalose concentration in group with  100 mmol/L benzyl alcohol  was 72±12.98 mmol/L，compared  with that in  groups of 10, 30 and 50 mmol/L, the statistical  difference were significant (p=0.000);  the hemolysis rate of loaded RBCs in group with 100 mmol/L of benzyl alcohol  was 17.99±3.75%, as compared with groups of 10, 30 and 50 mmol/L, the statistical difference  was significant  (p=0.000). It is concluded that benzyl alcohol can enhance the intracellular trehalose concentration. As concentration of benzyl alcohol ascends, the intracellular trehalose concentration increases.100 mmol/L benzyl alcohol may be proper for loading RBCs.

    Key words    benzyl alcohol; red blood cell; trehalose

    J Exp Hematol 2007; 15(4):882-884

    目前，输血已成为临床重要的治疗手段之一，据统计，90%的输血目的是为了补充红细胞。用现有的红细胞保存装备保存费用昂贵，不便运输，远远不能满足临床急救和突发事件或灾害事故的救援。冻干红细胞由于其性能稳定，可在常温下保存，保存时间长，保存费用低廉，易于再水化，输注方便，以固体干粉剂形式存在，体积小，便于运输，克服了目前血液保存的局限性，因此冻干红细胞的保存已成为研究的热点。

    冻干红细胞的研究已有30多年的历史，进展缓慢.。2004年，Satpathy等［1］利用渗透非平衡原理和磷脂膜相变相结合原理将海藻糖导入到红细胞内。2005年，Satpathy等［2］将负载海藻糖的红细胞冰冻干燥，再水化后血红蛋白回收率达59%。这项研究，为冻干红细胞的临床应用迈出了重要一步。2005年，我们在Satpathy实验的基础上，改进某些实验方法，用海藻糖负载红细胞，并进行冻干保存研究，实验结果与Satpathy的实验结果接近。在实验中我们发现，优化海藻糖负载红细胞技术，提高细胞内海藻糖浓度，是进一步提高冻干红细胞回收率的关键。苯甲醇为海藻糖负载红细胞的媒介，可大大提高红细胞海藻糖负载率，从而提高冻干红细胞血红蛋白回收率。

    材料和方法

    试剂

    海藻糖、蒽酮购自美国Sigma公司，三氯乙酸、浓硫酸分析纯购自北京化工厂，氰化血红蛋白试剂盒购自北京天来公司。苯甲醇 （纯度＞98%，密度1.04535，分子量108.14，毒性LD 50 mg/kg）购自北京化工厂。

    仪器

    MP4R低温离心机（IEC，USA产品），723型分光光度计（上海第三仪器厂产品），SL2数控层析冷柜（北京四环科学仪器厂产品）。

    制备浓集红细胞

    从解放军307医院取3人份新鲜全血，在4℃条件下，以329×g离心14分钟，弃上清及白膜（血小板及白细胞）；用等量PBS液清洗3遍，用530×g离心10分钟，弃上清，制成浓集红细胞。

    海藻糖负载红细胞

    以0.8 mol/L的海藻糖溶液为原液，配制10、30、50、100 mmol/L苯甲醇海藻糖溶液。实验以苯甲醇溶液浓度为准，分为10 mmol/L组、30 mmol/L组、50 mmol/L组、100 mmol/L组。将每份血均分于5小组，每组3个样品，浓缩红细胞与苯甲醇—海藻糖负载液以1∶3体积比混匀。每个样品设立空白对照，红细胞与不同浓度的苯甲醇溶液以1∶3体积比混匀。样品放置在4℃ SL2数控层析冷柜中，负载24小时。

    测定负载溶血率

    用氰化血红蛋白试剂盒，测定负载样品的吸光值，以2 000转/分钟离心15分钟，测定上清的吸光值。溶血率为上清吸光值比负载样品的吸光值。

    细胞内海藻糖量的硫酸蒽酮法测定

    负载后的红细胞离心弃上清，用等渗的PBS清洗3遍，加入3倍体积的10%的三氯乙酸混匀,萃取45分钟,共2次［3］。离心后收集上清，取上清1 ml,加入浓度为2%的硫酸—蒽酮溶液4 ml,煮沸10分钟, 自然冷却至室温，在620 nm波长下测定各样品吸光值。配制不同浓度的海藻糖标准溶液，绘制标准曲线，计算拟合方程，用拟和方程求出各样品的海藻糖含量，用温氏法［4］测定所萃取红细胞的压积，计算红细胞内海藻糖的浓度。

    数据处理

    数据用SPSS软件处理，实验结果用均值±标准差表示，采用随机区组方差分析方法处理实验数据。

    结    果

    不同浓度组红细胞内海藻糖浓度比较

    经海藻糖苯甲醇液负载的红细胞， 红细胞内海藻糖的浓度是海藻糖负载组内的糖浓度，减去对照组中红细胞内的糖浓度。实验结果见附表。结果显示100 mmol/L组负载红细胞内海藻糖浓度最高，达72±12.98 mmol/L，与其它各组相比较，有显著统计学差异（p=0.000）。红细胞来自9个健康献血者，45个样本。

    不同浓度组红细胞溶血率比较

    各浓度组溶血率结果见附表。随着苯甲醇浓度升高，负载红细胞的溶血率也在增加。在100 mmol/L组，负载红细胞内溶血率达17.99±3.75%，与其它各组相比较，有显著统计学差异（p=0.000）。

    讨    论

    红细胞在冰冻干燥过程中经历冰冻和干燥两个过程，目前的红细胞冻干技术主要无法克服干燥对细胞膜的损伤，其机制主要是干燥升华过程中，细胞膜结构水的去除，使组成细胞膜的磷脂、蛋白结构发生改变，细胞膜上的蛋白与蛋白、磷脂与蛋白相互作用，造成细胞膜大片融合破裂，细胞内容物的外漏［5］。而海藻糖可对抗低温和干燥对红细胞的损伤［6］。海藻糖是葡萄糖的二聚体，对人体无任何毒副作用，被广泛应用于食品、医药、农业等行业［7］。干燥状态，海藻糖在细胞膜周围形成一层水膜，以替代丢失的结构水膜，维持细胞膜上蛋白、磷脂正常的结构，保持细胞膜的完整性［8］。研究表明，海藻糖只有分布于细胞膜内外两侧，且细胞内的海藻糖达到100 mmol/L时，才能在低温和干燥状态下发挥生物学保护作用［9］。海藻糖是二糖，一般情况下，不能透过细胞膜，而红细胞也不能合成海藻糖，因此如何将海藻糖导入红细胞内，是红细胞冰冻干燥保存的关键所在。

    2005年，我们利用渗透非平衡原理和磷脂膜相变相结合的原理，将海藻糖导入到红细胞内冰冻干燥保存，并将负载了海藻糖的红细胞功能进行一系列评价。在最佳负载条件下，红细胞内海藻糖的浓度只有40 mmol/L，负载过程中红细胞溶血率接近20%，而变形性仅有0.0289±0.00738，负载海藻糖的红细胞冰冻干燥保存后，血红蛋白回收率约为52%［10］。细胞内的海藻糖浓度与冻干后红细胞血红蛋白回收率正相关，因此提高红细胞内海藻糖负载率，是优化负载技术的重要一步。

    苯甲醇由于具有防腐、消毒和轻微的麻醉作用，常被用做食品添加剂和注射针剂的稀释液。少量的苯甲醇进入人体后被肝脏分泌的酶催化分解为无毒物质而排除体外。目前临床上所用注射剂中,苯甲醇的安全剂量范围1%-2%（100 mmol/L换算成百分比浓度小于2%）。苯甲醇还可增加细胞膜的流动性，改善细胞膜的通透性，故用来做为海藻糖负载红细胞的媒介。实验研究，苯甲醇浓度为50-60 mmol/L，可增加细胞内膜的流动性，增大苯甲醇浓度，使细胞双层膜流动性增加，但不影响细胞的黏弹性（变形性），对红细胞溶血率影响也很小［11］。本实验研究了浓度为10、30、50、100 mmol/L苯甲醇对海藻糖负载红细胞的影响，随着苯甲醇浓度的增大，细胞内海藻糖浓度逐步增加，苯甲醇浓度为100 mmol/L时，细胞内海藻糖浓度为72±12.98 mmol/L，与其它各浓度组相比较有显著统计学差异（p=0.000）；苯甲醇浓度为100 mmol/L时，溶血率仅为 17.99±3.75%。综合苯甲醇的安全性、红细胞海藻糖负载率和溶血率三方面的因素，100 mmol/L苯甲醇负载浓度，是可用的负载浓度。苯甲醇作为媒介，负载红细胞的方法值得推广及进一步研究。

    总之，海藻糖为冻干红细胞的保存带来了新曙光，但海藻糖导入细胞内技术是红细胞冰冻干燥保存成功的关键一步，现有的海藻糖负载红细胞技术均有一定局限性。进一步改进负载方法，降低负载过程中红细胞的溶血率，提高海藻糖的负载率，防止负载过程中红细胞的变形性下降，仍是今后研究的焦点。

【参考文献】1Satpathy GR, Torok Z, Bali R, et al. Loading red blood cells with trehalose: a step towards biostabilization. Cryobiology,2004；9:123-136

2Torok Z, Satpathy GR, Banerjee M, et al. Preservation of trehaloseloaded red blood cells by lyophilization. Cell Preserv Technol, 2005：396-111

3周俊，刘景汉，欧阳锡林等.血小板胞内海藻糖测定方法的建立和评价.中国实验血液学杂志，2004；12：837-840

4丛玉隆，乐家新.现代血细胞分析技术与临床.北京：人民军医出版社，2005：180-181

5陈燕，陆志刚.海藻糖用于血细胞冻干保存中的研究进展.中国实验血液学杂志，2006；14：416-418

6Crowe JH, Hoekastra FA, Crowe LM. Anhydrobiosis. Annu Rev Physiol,1992;54:579-599

7樊志萍.海藻糖食用的安全性评价.食品与药品，2005; 7:25-27

8张丽杰,张雪莲,邸进申.新型食品添加剂海藻糖的发展前景.中国食品添加剂，2004；2：61-65

9Chen T, Acker JP, Eroglu A, et al. Beneficial effect of intracellular trehalose on the membrane integrity of dried mammalian cells. Cryobiology, 2001;43:168-181

10陈燕，陆志刚，韩颖.海藻糖负载红细胞及其冻干保存研究.中国实验血液学杂志，2006；14：605-609

11Chabanel a, Richard E , Chien AS, et al. Effects of benzyl alcohol on erythrocyte shape ,membrane hemileaflet fluidity and membrane viscoelasticity. Biochim Biophys Acta, 1995;816: 142-157