低剂量氟达拉滨、环磷酰胺联合供者NK细胞作为非清髓性预处理用于小鼠单倍相合造血干细胞移植

作者：于津浦， 曹水， 辛宁， 安秀梅， 齐静， 任秀宝    作者单位：天津医科大学附属肿瘤医院免疫室，天津市肿瘤防治重点实验室，天津 300060

【摘要】  本研究探讨低剂量氟达拉滨、环磷酰胺联合供者异体反应性NK细胞（flu+cy+alloNK）作为新的非清髓性单倍相合造血干细胞移植（haploidentical HSCT）预处理方案的可行性。利用免疫磁珠富集F1供鼠(H2d/b)脾脏NK细胞，检测其中Ly49C+、Ly49A+ 细胞的比例；LDH法检测其异体反应性。建立小鼠单倍相合造血干细胞移植模型，并比较清髓性方案（9 Gy TBI）、各种非清髓性方案(6.5 Gy TBI，flu+cy，及flu+cy+alloNK)的体内清髓效果、移植后供者嵌合率、GVHD的发生率及严重程度。结果表明： 与其他非清髓性预处理方案相比，flu+cy+alloNK组不能增加清髓程度，但可显著提高单倍相合移植后的供者嵌合率，移植后21天的嵌合率在骨髓为（28.70±5.90）%，脾脏为 (46.40±5.00)%，并持续2个月。与flu+cy组相比，flu+cy+alloNK组出现的GVHD反应轻微，仅有50%(5/10)受鼠出现体重减轻，flu+cy+alloNK组小鼠的肝脏、小肠、肾脏及皮肤的病理切片均未见明显的组织损伤。结论： 供者alloNK具有促进单倍相合供者造血干细胞植入，减轻GVHD强度的作用；低剂量flu+cy+alloNK方案为高龄和一般情况差的肿瘤患者开展单倍相合造血干细胞移植提供了新的途径。

【关键词】  非清髓性预处理

     Application of Low Dose of Fludarabine and Cyclophosphamide Combined with Donor NK Cells as a Non myeloablative Conditio ning Regimen for the Haploidentical Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Mice

    YU JinPu, CAO Shui, Xin Ning, AN XiuMei, QI Jing, REN XiuBao

    Department of Immunology, Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy, Tianjin Cancer Institute and Hospital, Tianjin Medical University, Tianjin  300060, China

    Abstract    This study was aimed to investigate  the feasibity  of low dose of fludarabine, cyclophosphamide  combined with  donor derived alloreactive NK cells as a new nonmyeloablative conditioning regimen in the haploidentical hematopoietic stem cell transplantation (haploidentical HSCT).  F1 derivedNK cells were enriched  with MACS magnetic separation system, in which the proportions of the Ly49C+ and Ly49A+ cells were detected by flow cytometry and the alloreactivity was measured by LDH method. The haploidentical HSCT models were constructed, and the myeloablativity in vivo, donor engraftment and the intensity of GVHD were compared between different myeloablative and nonmyeloablative conditioning regimens, including 9 Gy TBI, 6.5 Gy TBI, flu+cy, and flu+cy+alloNK. The results showed that the flu+cy+alloNK conditioning was nonmyeloablative, but the rate of donor chimerism after haploidentical HSCT was significantly higher as compared with other nonmyeloablative methods, which were (28.70±5.90)% in bone marrow and (46.40±5.00)% in spleen at  day 21  posttransplantation. When compared with the flu+cy conditioning, the intensity of GVHD was slight in the flu+cy+alloNK group, in which only a half of C57BL/6 recipients experienced weight loss, and no distinct pathological damages observed in the liver, intestine, kidney and skin samples. It is concluded  donor derivedalloreactive NK cells can facilitate engraftment of the haploidentical hematopoietic stem cells and mitigate GVHD. The flu+cy+alloNK conditioning  provides a new method for those elder patients with highrisk solid tumor undergoing  haploidenticalHSCT.

    Key words    alloreactive NK cell; haploidentical hemopoietic stem cell transplantation; nonmyeloablative conditioning regimen; fludarabine; cyclophosphamide

    J Exp Hematol 2007; 15(5):1013-1018

    亲缘间HLA单倍相合造血干细胞移植（haploidentical HSCT）供者容易获得，GVT效应显著，适合用于实体肿瘤的治疗。但haploidentical HSCT发生移植排斥和严重移植物抗宿主病（GVHD）的机率较高，因此寻找一种新的非清髓性预处理方案，在保证移植物顺利植入的基础上控制GVHD和各种严重并发症，是目前亟待解决的问题。

    在haploidentical  HSCT中，当供者NK细胞表面KIR受体与受者的MHCI类分子不相配时，会产生供者对受者(GVH)NK细胞同种反应性，特异性杀伤受者靶细胞，这种NK细胞被称为异体反应性NK（alloNK）。针对血液系统恶性肿瘤的动物实验和临床回顾性分析均表明，alloNK用于haploidentical   HSCT的预处理，具有促进植入、预防GVHD和减少复发等优点［1,2］。在本实验中，通过比较低剂量氟达拉滨、环磷酰胺联合alloNK（flu+cy+alloNK）与其他预处理方案的清髓效果、供者植入率和GVHD情况，初步探讨其在haploidentical  HSCT治疗实体瘤中的应用潜力。

     实验动物和药物

    供体鼠：清洁级（BALB/c×C57BL/6）F1(H2Db/d，♀)，8-12周龄，体重18-22 g；受体鼠，近交系C57BL/6(H2Db ，♀)，8-12周龄，体重18-22 g，均购自北京维通利华动物中心，为清洁级动物。受鼠饲养于天津医科大学动物实验中心层流房内，供鼠饲养在普通清洁动物房内，每天更换垫料，受鼠移植前7天及移植后饮用的水中加入庆大霉素300 mg/L，饲料经60Co照射灭菌。试验用药：氟达拉滨（flu, 福达华，先灵公司产品）；环磷酰胺（cy，Sigma公司产品）。

    供者NK细胞的富集

    供者NK细胞的富集按照小鼠NK细胞分选试剂盒（Miltenyi Biotec公司产品） 的操作说明进行。F1供体鼠无菌取脾脏，制备单细胞悬液，用PBS+0.5% BSA+2 mmol/L EDTA洗液洗涤后弃上清，以40 μl/107 cells的浓度重悬细胞，以10  μl/107 cells比例加入生物素标记的单克隆抗体混合液（包括抗L3T4, Ly2, Ly1, CD19, Gr1和Ter119单克隆抗体），4-8℃孵育10分钟，然后以20  μl/107 cells比例加入包被抗生物素单克隆抗体的磁珠，4-8℃继续孵育15分钟，离心洗涤后用500  μl洗液重悬，过柱，收集分选的细胞，用FITCNK1.1, FITCLy49A, PELy49C(BD PharMingen,  Bioscience公司产品)标记，流式细胞仪检测分选细胞中NK富集度，台盼蓝检测活率。

    供者NK细胞异体反应性的测定

    用含10% FCS的RPMI 1640培养液调整上述富集的供者NK细胞浓度为2×106/ ml，作为效应细胞。分别制备C57BL/6和F1来源脾细胞悬液，在体外用25 mg/ml的PHA连续刺激72小时，收集活化细胞。将NK细胞敏感的Yac1细胞及H2抗原不同的C57BL/6和F1来源的靶细胞离心洗涤后调整细胞浓度为1×105/ ml，作为靶细胞。按效靶比（E/T）20∶1、10∶1和5∶1，将效应细胞和不同靶细胞混合加入96孔凹孔板内，200  μl/well，然后置于37℃、5% CO2的条件下培养4小时，根据LDH杀伤试剂盒（Promega公司产品）的操作说明书测定各孔的细胞杀伤率。

    不同预处理方案的体内清髓效果比较

    根据不同预处理方案，将28只小鼠分为4组，每组7只，分别为①9 Gy TBI组，②6.5 Gy TBI组，③flu+cy组，④flu+cy+ alloNK组。第①组和第②组C57BL/6小鼠分别于移植当天接受照射源为137Cs γ射线9 Gy和6.5 Gy的全身照射，剂量率为0.81 Gy/min。第③组和第④组的C57BL/6小鼠在移植前5天开始腹腔注射flu 100 mg/（kg·d）（移植前5天-移植前1天），cy 150 mg/（kg·d）（移植前2天-移植前1天），其中第④组C57BL/6小鼠在移植当天同时经尾静脉给予供者alloNK细胞，每只小鼠2×106细胞。预处理后的小鼠不行移植，在移植后1、2、3、7和10天，分别处死小鼠，取小鼠脾脏和单根股骨，制备单细胞悬液，台盼蓝法计数脾脏单个核细胞数和骨髓有核细胞数。以正常C57BL/6小鼠的骨髓和脾脏有核细胞作为0天对照。

    不同预处理方案的小鼠haploidentical HSCT移植模型的建立

    根据上述分组，再取72只C57BL/6小鼠行haploidentical HSCT，每组18只，建立不同预处理方案的小鼠haploidentical HSCT移植模型。第①组和第②组分别在照射后6小时经尾静脉给予（BALB/c×C57BL/6）F1小鼠的骨髓细胞，每只小鼠1.3×107细胞。第③组和第④组则在腹腔给药后5天从尾静脉给予F1小鼠的骨髓细胞每只小鼠1.3×107细胞。

    不同预处理方案的小鼠haploidentical HSCT移植后供者植入的监测

    取行haploidentical  HSCT的C57BL/6小鼠32只，根据上述分组，每组8只，于移植后7、14、21和28天取不同预处理组的C57BL/6小鼠脾脏及骨髓，制备单细胞悬液，用FITCH2Kd单克隆抗体（BD PharMingen公司产品）经流式细胞仪检测H2d阳性细胞比例，确定受者C57BL/6鼠中供者F1鼠来源细胞的比例，对haploidentical HSCT移植后供者植入情况进行监测。以FITCIgG2α为同型对照，并取BALB/c和C57BL/6小鼠脾脏细胞分别作为阳性对照和阴性对照。

    不同预处理方案的小鼠haploidentical HSCT移植后GVHD的观察

    取行haploidentical HSCT的C57BL/6小鼠40只，根据上述分组，每组10只，于移植后每日测量小鼠体重，连续观察小鼠体重、体位、毛发、大小便及活动能力的改变。以移植前1天体重为参照，计算体重变化百分数，根据体重降低情况对移植后GVHD进行评分：0=正常，1=轻度，2=中度，3=重度。体重下降<10%为轻度，10%-20％为中度，>20%为重度。同时在移植后7、14、21和28天取各组小鼠的肝脏、小肠、肾脏及皮肤标本，以甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片、HE染色，观察是否存在GVHD的病理表现。

    统计学分析

    所有数据采用±SD表示，统计学分析利用SPSS 13.0软件包，定量资料的比较采用单因素方差分析和重复测量数据的统计分析，p<0.05为有统计学意义。

    结    果

    供者NK细胞的富集

    经试剂盒分选后的供者NK细胞经台盼蓝染色，细胞活率达95%以上，利用FITCNK1.1标记细胞后经流式细胞仪检测，分选富集度可从（19.85±4.27）%上升到（74.63±5.49）%（图1）。

    供者alloNK表型和异体反应性

    与C57BL/6不同，F1来源供者NK细胞中除含有（34.80±2.52）%的Ly49C+细胞，还有（22.24±2.95）%的Ly49A+细胞（图2）。以富集的供者和受者NK细胞作为效应细胞，分别与NK细胞敏感的不同预处理条件下的清髓效果

    以正常C57BL/6小鼠作为0d对照，预处理后1、2、3、7和10天计数9 Gy TBI组、6.5 Gy TBI组、flu+cy组、flu+cy+alloNK组小鼠骨髓和脾脏有核细胞总数，绘制出如图3的曲线。结果显示，9 Gy TBI组可以实现完全清髓，在10天内骨髓和脾脏的有核细胞显著降低至几近于零，而其他3组均表现为可逆的非清髓性造血抑制，6.5 Gy TBI组的造血抑制轻微，而flu+cy组和flu+cy+alloNK组的早期造血抑制较明显（p<0.01），其骨髓和脾的有核细胞分别在预处理后3和4天降至最低，分别为(2.80±0.15)×106、(2.19±0.18)×106；(3.92±0.30)×106、(3.40±0.21)×106，但在7-10天骨髓和脾的有核细胞数可自行恢复至正常水平。

    不同预处理条件下的供者植入情况

    9 Gy TBI组在haploidentical HSCT后1月内显示完全供者植入，移植后28天骨髓的供者嵌合率为(98.2±3.4)%，而6.5 Gy TBI组和flu+cy组则在早期迅速出现移植排斥，移植后28天的骨髓供者嵌合率分别为(6.08±0.46)%，(10.2±2.40)%。flu+cy+alloNK组供者嵌合率虽然在早期也出现下降，但21天后逐渐稳定在骨髓（28.70±5.90）%，脾脏 (46.40±5.00)%，并持续2个月（图4）。

    不同预处理方案的小鼠haploidential HSCT移植后的GVHD情况

    9 Gy TBI组早期出现严重的GVHD反应，移植后8天体重从(19.76±0.34)g降至(16.88±0.79)g，移植相关死亡率达60%(6/10)，平均存活时间为(10.2±3.46)天，而在非清髓性的6.5 Gy TBI组、flu+cy组和flu+cy+ alloNK组均未出现严重的GVHD反应和移植相关死亡，小鼠体重减轻均未超过20%（图5，附表）。与flu+cy组相比，flu+cy+alloNK组出现的GVHD反应轻微，仅有50%(5/10)受鼠出现体重减轻。与flu+cy组小鼠出现肝脏片状坏死、肠粘膜充血肿胀等GVHD典型的病理特征相比，flu+cy+ alloNK组的肝脏、小肠、肾脏及皮肤的病理切片均未见明显的组织损伤(图6)。

     讨    论

    传统的标准清髓性预处理方案的有效性已得到证实，但由于移植相关死亡率较高，通常在20%-50%之间，因此认为不适合于60岁以上的老年患者，尽管大部分干细胞移植的适应证主要出现在此阶段［3］。自从上世纪80年代，供者淋巴细胞输注(DLI)被用于移植后复发的预防和治疗，大量临床数据提示稳定植入的供者淋巴细胞可能具有较最大可耐受剂量的放化疗更强的抗肿瘤效应。这一发现直接导致临床上非清髓性造血干细胞移植（NST）的快速发展。在此过程中，供者干细胞的植入被作为一种诱导免疫耐受的途径，可使功能完备的供者淋巴细胞发挥免疫治疗作用［4］。

    目前已提出的NST方案很多，根据预处理方案的强弱可分为两类，一类是真正意义上的NST方案，其产生的骨髓抑制是可逆的，即使不行造血干细胞移植，患者自身得造血可在28天内恢复，植入后嵌合体通常为混合嵌和体。另一类是减低剂量的预处理方案（RIC），如果不行造血干细胞移植造血不能恢复，移植后早期即可产生完全嵌合体。这类方案虽然被划为NST方案，但从结果看仍属于完全清髓方案［5］。

    在小鼠非清髓性haploidentical HSCT模型中,常用的预处理方案包括各种免疫抑制药物，如氟达拉滨(flu)，环磷酰胺(cy)； 烷基化药物，如白消胺(busulfan)等，以及为抑制宿主T淋巴细胞对移植物的排斥而采用的低剂量全身照射(TBI)和(或)多种抗体，如抗CD45抗体，抗CD154抗体，CTLA4融合蛋白，抗淋巴细胞血清等［6］。这种NST方案强度稍低于清髓性方案,可以保证供者造血干细胞的稳定植入。Flu是一种常用的非清髓性预处理药物，可通过生成具有免疫抑制作用的嘌呤类代谢产物而清除T细胞克隆［7］。同时研究表明， flu通过抑制细胞DNA合成而提高免疫细胞对cy的敏感性，因此flu和cy联合具有明显的协同作用，可以更有效控制宿主T淋巴细胞对移植物的排斥反应［8］。但目前报道的flu和cy联合的非清髓性预处理方案，为保证移植成功，flu和cy的剂量均比较大，而这对于高龄的恶性肿瘤患者往往是不能承受的。Masaki1等［6］的研究表明，虽然降低flu和cy的剂量可以降低移植相关并发症和死亡率，但也增加了移植排斥的发生率。

    人类和小鼠的NK细胞通过表面的KIR受体识别靶细胞表面MHCI类分子抗原决定簇，并传递抑制信号。KIR受体为克隆性分布，每一个成熟的NK细胞至少表达一种针对自身MHC I类分子特异性的抑制性KIR。在alloHSCT中，当受者缺乏供者NK细胞KIR特异性识别的MHCI类分子，即所谓"GVH方向不相合"时，供者NK细胞被激活，成为alloNK细胞。AlloHSCT过程中供者alloNK细胞通过攻击受者的抗原呈递细胞、T细胞及体内残存肿瘤细胞，起到预防GVHD，促进植入，治疗并预防肿瘤复发的作用［9-11］。

    为了在尽量降低药物毒性和GVHD的情况下实现稳定的供者植入, 本实验中我们将低剂量flu+cy与alloNK联合（flu+cy+alloNK）,并与完全清髓方案（9 Gy TBI）、其他NST方案(6.5 Gy TBI; flu+cy)进行比较,以探讨低剂量flu+Cy+alloNK作为新NST预处理方案的可行性。

    与国内常采用的H2b→H2d/b的移植模型不同，我们采用H2d/b→H2b的单倍相合移植模型，以去除供者T细胞的异体反应性对实验结果的干扰，突出供者alloNK的作用。利用小鼠NK细胞分选试剂盒富集单倍相合供者NK细胞，利用FITCNK1.1抗体检测NK细胞富集度，可从分选前的（19.85±4.27）%上升到（74.63±5.49）%，同时活率高于95%。通过流式细胞术检测显示，富集的供者来源NK细胞中除含有（34.80±2.52）%的Ly49C+细胞，还有较高比例的可以特异性识别并杀伤受者C57小鼠细胞的Ly49A+细胞，其值达（22.24±2.95）%。杀伤实验也表明，在不同效靶比下供者NK细胞均可显著杀伤Yac1细胞和受者来源靶细胞，提示富集的供者alloNK细胞具有异体反应性。

    比较不同预处理条件下的清髓情况，9 Gy TBI组可以实现完全清髓，在10天内骨髓和脾脏的有核细胞显著降低至几近于零，而其他3组均表现为可逆的非清髓性造血抑制。6.5 Gy TBI组的造血抑制轻微，而flu+cy组和flu+cy+alloNK组的早期造血抑制较明显，其骨髓和脾脏的有核细胞分别在移植后3天和移植后4天降至最低，在7-10天可自行恢复至正常水平。与Ruggeri［12］报道的结果不同，我们并未观察到alloNK促进清髓的效果，这可能由于我们采用了不同的非清髓性预处理方案，且强度较低之故。

    尽管flu+cy组和flu+cy+alloNK组的清髓效果接近，但供者植入情况和GVHD的发生率却相差很多。实验结果表明，9 Gy TBI组行haploidentical HSCT后可以在1月内实现完全供者植入，但早期即出现严重的GVHD反应，移植相关死亡率达60%(6/10)，平均存活时间为(10.2±3.46)天。尽管6.5 Gy TBI组，flu+cy组，和flu+cy+ alloNK组均未出现严重的GVHD反应和移植相关死亡，但6.5 Gy TBI组和flu+cy组在早期迅速出现移植排斥,而flu+cy+alloNK组供者嵌合率在移植后21天逐渐稳定，在骨髓为（28.70±5.90）%，脾脏为 (46.40±5.00)%，并持续2个月。与flu+cy组小鼠出现肝脏片状坏死、肠黏膜充血肿胀等GVHD典型的病理特征相比，flu+cy+ alloNK组出现的GVHD反应轻微，其肝脏、小肠、肾脏及皮肤的病理切片中均未见明显的组织损伤。

    我们的研究结果表明，低剂量氟达拉滨、环磷酰胺与供者alloNK联合，不仅降低了单倍相合alloHSCT预处理强度和相关毒性，还可能实现供者的稳定植入，并降低GVHD反应强度和移植相关死亡率，因此它有望成为适合高龄及一般状况差的肿瘤患者的新的非清髓性单倍相合alloHSCT预处理方案。

【参考文献】1李晓红，高春记. 异基因造血干细胞移植中NK细胞的作用. 中国实验血液学杂志，2006；14：845-848

2陈纯，黄绍良. 异基因造血干细胞移植中杀伤细胞抑制性受体(KIR)在GVHD和GVL发生中的作用.中国实验血液学杂志, 2004; 12: 236-243

3Slavin S. Reduced intensity versus truly nonmyeloablative conditioning for stemcell transplant recipients. Transplantation, 2004;78:964-965

4Slavin S, Nagler A, Naparstek E, et al. Nonmyeloablative stem cell transplantation and cell therapy as an alternative to conventional bone marrow transplantation with lethal cytoreduction for the treatment of malignant and nonmalignant hematologic diseases. Blood, 1998;91: 756-763

5LeBlanc K, Remberger M, Uzunel M, et al. A comparison of nonmyeloablative and reducedintensity conditioning for allogeneic stemcell transplantation. Transplantation, 2004; 78:1014-1020

6Kuwatani M, Ikarashi Y, Mineishi S, et al. An irradiationfree nonmyeloablative bone marrow transplantation model: importance of the balance between donor Tcell number and the intensity of conditioning. Transplantation,2005;80:1145-1152

7Carella AM. Treatment of hematological malignancies with allogeneic nonmhyeloablative stem cell transplantation: conditioning regimens with fludarabine. Hematol J, 2004; 5 （Suppl 1）:S68-S75

8Petrus MJ, Williams JF, Eckhaus MA, et al. An immunoablative regimen of fludarabine and cyclophosphamide prevents fully MHCmismatched murine marrow graft rejection independent of GVHD. Biol Blood Marrow Transplant, 2000; 6(2A): 182-189

9Ruggeri L, Capanni M, Martelli MF, et al. Cellular therapy： exploiting NK cell alloreactivity in transplantation. Curr Opin Hematol, 2001; 8:355-359

10Giebel S, Locatelli F, Lamparelli T, et al. Survival advantage with KIR ligand incompatibility in hematopoietic stem cell transplantation from unrelated donors. Blood,2003; 102:814-819

11Ruggeri L, Capanni M, Urbani E, et al. Effectiveness of donor natural killer cell alloreactivity in mismatched hematopoietic transplants. Science, 2002;295(5562): 2097- 2100