T细胞急性淋巴细胞白血病免疫表型分析

作者：陈丽娟，李建勇，吴雨洁，杨慧，钱思轩，吴汉新，陆化，徐卫，盛瑞兰    作者单位：南京医科大学第一附属医院、江苏省人民医院血液科， 南京 210029

【摘要】  本研究探讨T细胞急性淋巴细胞白血病（TALL）免疫表型特点。应用一组系列相关单克隆抗体和CD45/SSC设门的三色流式细胞术对140例TALL进行免疫表型检测。结果显示，白血病细胞表面T系抗原表达依次为CD7>CD2>CD3>CD5，近20%患者CD10表达阳性。140例患者中12例带有B系抗原标记，阳性率达8.57%；136例中31例带有髓系抗原标记，阳性率达22.79%，所有病例均无CD14表达。干/祖细胞标记CD34表达阳性率31.06%，41例CD34＋ TALL髓系抗原表达15例，阳性率36.59%，91例CD34- TALL髓系抗原表达14例，阳性率15.38％, 二者具有统计学差异（p<0.01）。儿童TALL CD3表达高于成人（p<0.05），而CD33表达明显低于成人（p<0.01） 结论： 免疫表型分析是诊断TALL的重要手段，TALL免疫表型具有异质性。

【关键词】  急性白血病

    Immunophenotyping Characteristics of Tcell Acute Lymphoblastic Leukemia

    CHEN LiJuan, LI JianYong, WU YuJie, YANG Hui, QIAN SiXuan, WU HanXin, LU Hua,

    XU Wei, SHENG RuiLan

    Department of Hematology, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Jiangsu Province People  Hospital, Nanjing 210029, China

    Abstract    The objective of this study was to investigate the immunophenotypic characteristics of  Tcell acute lymphoblastic leukemia (TALL). Immunophenotyping was performed in 140 TALL patients by flow cytometry using a panel of monoclonal antibodies and CD45/SSC gating. The results showed that the Tlineageassociated antigen expressions were  CD7>CD2>CD3>CD5  successively. The positive rate of CD10 was 19.42%  in  patients. Among 140 cases of TALL, 12 (8.57%)  was accompanied by  Blineage associated antigen expression. Myeloid antigen expression was identified in 31 out  of  136 cases (22.79%). None of them  expressed CD14 antigen. The positive rate of CD34 was 31.06%. The positive rate of myeloid antigen expression in CD34＋ TALL (36.58%) was significantly higher than that in CD34-  TALL (15.38%)  (p<0.01). The expression of CD3 in child  TALL was higher than that in adult TALL,  whereas the expression of CD33  in children  was lower than that in adults.  It is concluded that immunophenotyping is an important tool for   diagnosis of TALL. Immunophenotypic characteristics of TALL is heterogeneous.

    Key words    Tcell acute lymphoblastic leukemia; acute leukemia;  immunophenotyping

    J Exp Hematol 2007; 15(4):692-695

    急性淋巴细胞白血病（ALL）是一组免疫表型高度异质性的淋巴系统恶性克隆性疾病。根据其免疫表型分为B细胞型，T细胞型及T/B混合型，其中T细胞型ALL(TALL)占ALL的15%-25％，具有不同于B系ALL的独特的临床、免疫学、细胞遗传学和分子生物学特点。虽然近年来国外文献报道由于应用含有大剂量环磷酰胺及阿糖胞苷的化疗方案，TALL的预后有了较大改善，但仍有部分TALL疗效较差，即使大剂量化疗也不能达到完全缓解， 因此TALL疗效的异质性促使我们对其特征进行进一步研究。本研究通过分析既往诊断TALL的140例免疫表型，总结其免疫表型特点。

    材料和方法

    临床资料

    1996年6月-2006年6月，经细胞形态学、免疫分型诊断的TALL患者140例，其中男94例，女47例，男∶女=2∶1，中位年龄15.5(1-67)岁。成人78例，男58例，女20例，男∶女=2.9∶1，年龄15-67岁；儿童62例，男35例，女27例, 男∶女=1.3∶1，年龄1-14岁。

     用骨髓涂片进行常规细胞形态学及细胞化学检查，按照FAB分类标准骨髓中原始淋巴细胞≥30%，诊断为急性淋巴细胞白血病。

    免疫表型分析

    取肝素抗凝的新鲜骨髓或外周血标本，调整细胞数至(0.5-1)×106/ml，用三色荧光(三种荧光素为FITC, PE, PECy5)直接免疫标记法检测。以CD45/SSC设门(gating)，每管均加人PECy5CD45，共检测14种胞膜抗原：T淋巴细胞系列(淋系)的CD2、CD3、CD5、CD7；B淋巴系列的CD19、CD20、CD22；T、B均表达抗原CD10；髓细胞系列(髓系)的CD13、CD14、CD33、CD42b、CD61；干细胞及祖细胞标记CD34。部分出现两系以上标记加做胞浆抗原cMPO、cCD79 和cCD3(所有单克隆抗体均购自法国Immunotech公司)。用流式细胞仪(BeckmanCoulter公司，Epics XL型，488 nm激发光源)检测，每管获取并分析10 000个细胞，采用Expo32 ADC分析软件分析。幼稚细胞抗原阳性标准：CD34和胞浆抗原≥10%；其它抗原≥20%［1］。

    统计学方法

    计数资料比较用χ2检验，以p<0.05为差异具有显著性意义。

    结    果

    CD45/SSC双参数设门的检测

    采用CD45/SSC双参数设门方法能清楚地区分骨髓或外周血中的淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、有核红细胞和幼稚细胞群。幼稚细胞的SSC值与正常淋巴细胞的SSC值相似或稍高，CD45的荧光强度与粒细胞荧光强度相似。

    免疫表型特点

    14种胞膜抗原表达的阳性率见表1。白血病细胞表面T系抗原表达依次为CD7>CD2>CD3>CD5，近20%患者CD10为阳性。140例患者中12例带有B系抗原标记，阳性率达8.57%；136例中31例带有髓系（My）标记，阳性率达22.79%，CD13表达高于CD33，所有病例均无CD14表达。干/祖细胞标记CD34表达阳性率31.06％，41例CD34＋ TALL髓系抗原表达15例，阳性率36.59%，91例CD34- TALL髓系抗原表达14例，阳性率15.38%，二者具有统计学差异（p<0.01）。CD34＋ TALL中CD10表达10例，CD34- TALL中CD10表达16例，二者无统计学差异（p>0.05），且无年龄相关性。对上述抗原不能确定为TALL的15例患者，予以cCD3、cMPO和cCD79 检测，以cMPO和cCD79 阴性，cCD3阳性明确诊断，其中10例CD3阴性，另有5例未检测到胞膜抗原CD3。

    依据2001年WHO的积分系统评分标准,T系积分＞2分诊断为TALL［2］。在140例中，107例可确诊TALL，尚有33例不能明确诊断，均未检测到胞浆抗原。其中19例T系积分在1.5-2分，不伴有B系及髓系抗原表达。另有12例T系积分在2.5分以上，8例伴有B系胞膜抗原表达，大部分积分1，2例积分2分，但所有B系抗原均为弱表达，低于30%；8例伴有髓系抗原表达，积分均为1分；4例同时伴有B系及髓系标记。3例T系积分1.5分，T系抗原均强表达（>60%），分别伴有弱表达（<25%）的CD19、CD20和CD13抗原。

    TALL免疫表型与年龄的关系

    儿童和成人胞膜抗原表达阳性率见表2。儿童TALL CD2、CD3、CD7和CD34的表达高于成人，而CD10、CD13和CD33较成人TALL低。CD3表达明显高于成人（p<0.05），而CD33表达明显低于成人（p<0.01），其余表面抗原表达二者均无统计学差异。

     讨    论

    ALL男性发病比例高于女性，一般为2∶1，儿童多见。本组140例经形态和免疫分型诊断的TALL，男∶女＝2∶1，中位年龄15.5岁，此与文献报道一致［3］。国内外文献报道，儿童ALL以T系为主，甚至男女比例达8-9∶1，但本组资料儿童TALL男女比例仅为1.3∶1，低于成人男女比例2.9∶1。

    CD7是T系的一个良好标志，具有多向分化潜能的造血干/祖细胞阶段也可表达此抗原，CD3是TALL诊断的特异性和敏感性均较高的指标，CD7和CD3一般在BALL中无表达，可用于TALL和BALL的鉴别诊断，CD2和CD5在TALL中表达率高，但在BALL中也有部分表达，特异性低于CD3和CD7。本组TALL患者中白血病细胞表面T系抗原表达依次为CD7>CD2>CD3>CD5，阳性率分别为97.14%、82.14%、74.78%和73.08%，与文献报道相符［3］。10例CD3阴性患者cCD3检测呈阳性，说明cCD3敏感性更高，因此对于伴有其它T系抗原标志而CD3阴性患者，应常规检测cCD3。李建勇等［3］报道，CD3在儿童TALL中表达明显高于成人，本组资料也显示了相似的结果。

    CD10原是普通型BALL细胞上一种相关抗原，但30%-40% TALL表达CD10，因此欧洲急性白血病免疫分型小组将CD10作为TALL的一个标志［4］，2001年WHO的积分系统评分标准将CD10定为在T和B急淋中各积1分。因此可认为CD10是T、B两系抗原。Consolini等［5］分析了2038例儿童CD10＋ ALL CD10表达的预后意义，结果显示CD10表达无论在TALL还是在BALL都不是一个独立的预后因素，在BALL中与年龄<9岁及标危分组等临床特征相关，但TALL中与年龄和分组无相关性。CD10＋  TALL的无病生存率较CD10＋  BALL低。我们的研究显示近20% TALL表达CD10，且其表达与年龄亦无相关性。

    CD19、CD20和CD22是BALL敏感性和特异性高的一个标志，李建勇等［3］报道41例TALL均未见CD19和CD22的表达。但本组140例患者中12例带有B系抗原标记，阳性率达8.57%，CD19、CD20和CD22的阳性率分别为6.43%、3.13%和3.03%。分析此12例患者，2例B系抗原高表达者（>30%）cCD79 均阴性，排除了T/B混合性ALL可能，说明有极少部分TALL伴有B系特异性抗原表达。其余10例虽然未检测cCD79 表达情况，但B系抗原均仅为弱表达（<25%），有可能在设门时白血病细胞群体与少量正常B淋巴细胞群体无法完全分开，因此部分学者将淋巴细胞抗原阳性标准设为30%以上。但对于那些伴有B系抗原弱表达的TALL患者最好进行常规检测胞浆抗原cCD79 表达，以排除双表型ALL可能。

    一般认为，伴髓系抗原表达的ALL起源于比淋巴定向干祖细胞更原始的干细胞。10%-30% ALL患者白血病细胞表达髓系抗原（My＋ALL），13%-16% TALL表达CD13或CD33，单核细胞特异性标志CD14在TALL基本不表达［6］。本组病例My+ TALL阳性率为22.79%，略高于文献报道。CD13和CD33表达阳性率分别为11.76%和8.96%，所有病例均无CD14表达。ALL患者白血病细胞My表达的临床意义还存在争议，部分学者认为，My+ ALL预后差［7,8］，Vitale等［9］研究成人TALL发现My+TALL预后较My-TALL差，完全缓解率54% vs 84%。本组成人TALL 髓系抗原CD33表达明显高于儿童，这可能是成人TALL预后较儿童差的原因之一，但这尚有待临床资料观察证实。目前大多数观点认为My表达与临床特征及预后无相关性。Pui等［10］研究了儿童ALL患者，结果显示My+ALL和My-ALL患者的3年无病生存率分别为85%和75%，My表达不影响儿童ALL的预后。

    CD34是造血干细胞的特异性标记, 在急性髓细胞白血病和ALL均有较高的表达。Pui等［11］研究儿童ALL CD34表达，发现其与免疫分型有密切关系，早前BALL>前BALL>TALL，分别为83%、61%和46%。在BALL中CD34表达与好的预后因素：年龄1-10岁、白种人、CD10表达、无中枢神经系统白血病、低乳酸脱氢酶及超二倍体有关，5年无病生存率高于CD34-BALL。但CD34表达在TALL中预后意义相反，与中枢神经系统白血病和CD10-密切相关，与好的预后因素无相关性。Vitale等［9］研究也显示TALL CD34阳性率34%，CD34＋ TALL完全缓解率低于CD34- TALL，CD34＋ TALL预后差。本研究中CD34阳性率为31.06%，与Vitale等［9］报道基本一致。虽然CD34＋ TALL与CD34- TALL CD10表达无差异，CD34＋ TALL My阳性表达高于CD34- TALL，二者具有统计学差异，与李建勇等［3］报道基本一致 ，这可能与CD34＋  TALL预后差有关。

    根据WHO积分系统本组中有19例患者T系积分仅在1.5-2分，但不伴有B系及髓系抗原表达。这部分患者虽然T系积分未达2.5分，但由于是早年发病患者，当时不具备检测cCD3的条件，且不伴有任何B系及髓系抗原表达，应该仍归于TALL范畴，目前在检测条件完善的情况下此类型患者应常规检测cCD3表达。

    本研究表明，免疫表型分析是诊断TALL的重要手段，TALL免疫表型存在一定异质性，这或许是导致TALL临床表现异质性的重要原因。在检测中出现两系以上标记及单系标记未达2.5分者应常规加做胞浆抗原cMPO、cCD79 和cCD3明确诊断。

【参考文献】1吴雨洁，李建勇，仇海荣等. 四色流式细胞术分析骨髓增生异常综合征原始细胞免疫表型. 中国实验血液学杂志，2006；14：50-53

2宋君红，李建勇，吴雨洁等. 50例成人急性淋巴细胞白血病免疫表型分析. 中国血液流变学杂志，2006；16：90-93

3李建勇，阮长耿，华东等. 流式细胞术在急性淋巴细胞白血病免疫分型中的应用. 江苏医药，1999；25：750-751

4Bene MC, Castoldi G, Knapp W, et al. Proposals for the immunological classification of acute leukemias. European Group for the Immunological Characterization of Leukemias (EGIL). Leukemia，1995；9：1783-1786

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6Pui CH, Rubnitz JE, Hancock ML, et al. Reappraisal of the clinical and biologic significance of myeloidassociated antigen expression in childhood acute lymphoblastic leukemia. J Clin Onco1，1998；16：3768-3773

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8Wiersma SR, Ortega J, Sobel E, et al. Clinical importance of myeloidantigen expression in acute lymphoblastic leukemia of childhood. N Engl J Med，1991；324：800-808

9Vitale A, Guarini A, Ariola C, et al. Adult Tcell acute lymphoblastic leukemia: biologic profile at presentation and correlation with response to induction treatment in patients enrolled in the GIMEMA LAL 0496 protocol. Blood，2006；107：473-479

10Pui CH, Behm FG, Singh B, et al. Myeloidassociated antigen expression lacks prognostic value in childhood acute lymphoblastic leukemia treated with intensive multiagent chemotherapy. Blood，1990；75：198-202

11 Pui CH, Hancock ML, Head DR, et al. Clinical significance of CD34 expression in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood，1993；82：889-894