恶性血液病FLT3基因突变的检测及临床意义

作者：刘红,于红,贾红英 ,张文,国承杰    作者单位：青岛大学医学院微生物教研室，青岛 266021

【摘要】  为了探讨FLT3基因及FLT3内部串联重复(ITD )突变与恶性血液病的关系及临床意义，采用PCR结合DNA测序技术分析32例急性髓系白血病(AML)、18例急性淋巴细胞白血病(ALL)、2例急性杂合性白血病(AHL)、12例骨髓增生异常综合征(MDS)、10例慢性粒细胞白血病（CML）、3例非何杰金淋巴瘤（NHL）及9例多发性骨髓瘤（MM）患者骨髓单个核细胞中FLT3基因及FLT3/ITD突变,分析FLT3/ITD阳性患者的临床特征及疗效。结果表明：在32例AML患者中5例FLT3/ITD (15.6%)阳性,其中7例M3中1例、10例M4中1例、10例M5中3例；而在18例ALL、2例AHL、12例MDS和10例CML患者中未检测到FLT3/ITD突变；在3例非何杰金淋巴瘤（NHL）、9例多发性骨髓瘤（MM）患者中亦未检测到FLT3基因。对2例特征性突变进行了测序，其结果显示, ITD位于外显子14,长度为27-63 bp, 为单纯串联重复, FLT3/ITD序列包括有2个SH2结合结构域（YEYV与YEYDLK），其中1例出现氨基酸的替换，其ITD序列及氨基酸的替换均具有独特性，均未改变FLT3阅读框架。临床研究表明，FLT3/ITD阳性AML患者外周血白细胞数高(p<0.01)，骨髓原始细胞比例高（p<0.01），化疗后有低缓解率趋势。结论：FLT3/ITD突变多见于M5患者，为框内突变 。FLT3/ITD阳性的AML患者外周血白细胞数高，骨髓原始细胞比例高，伴低缓解率趋势。FLT3/ITD基因突变可作为预测AML预后的一个指标。

【关键词】  恶性血液病

   Detection  of  FLT3  Gene Mutation  in  Hematologic  Malignancies  and  Its  Clinical  Significance

    LIU  Hong1，2，YU  Hong1 ，JIA HongYing2， ZHANG Wen2，GUO ChengJie2

    1Department of Microbiology, Qingdao University Medical College, Qingdao 266021, China ;2Department of Medical Laboratory Examination, Zibo Municipal Central Hospital，Zibo 255036，China

    Abstract    To  study the FLT3 gene expression and its internal tandem duplication  in hematologic malignancies and its clinical significance, polymerase chain  reaction (PCR)  and DNA sequencing  were used to detect the FLT3/ITD mutation in blast cells of bone marrow from 86 patients with hematologic malignancies, including 32 cases of acute myeoloid  leukemia (AML), 18 cases of acute lymphoblastic  leukemia(ALL), 2 cases of acute hybrid leukemia (AHL), 12 cases of myelodysplastic syndromes (MDS), 10  cases of chronic myelogenous leukemia (CML), 3 cases of nonHodgkin′s lymphoma (NHL) and 9 cases of multiple myeloma (MM). The resultes showed that the expression of  FLT3 / ITD  gene could be   detected  in  5 of 32 (15.6%) AML patients, including 1/7 of M3, 1/10 of M4 and 3/10 of M5. More FLT3 aberrations were found in AML M5. No FLT3/ITD was found in 18  cases of ALL, in 2 cases of  AHL, in 12 cases of MDS and in  10 cases of   CML. No  FLT3 was found  in 3 cases of NHL and in 9  cases of MM. Sequence analysis in 2 case with abnormal PCR electrophoretic  patterns  revealed that the ITDs were located within exon 14 from 27 to 63 bp,  which  was a simple  tandem  duplication，and  did not altered the reading frame. FLT3/ITD was associated  with a  higher peripheral  blood white cell count (p<0.01),     higher percentage of bone marrow  blast cells (p<0.01)  and  lower complete mission  rate.  It is concluded that more FLT3/ITD mutation occurs in AMLM5 patients. Sequence of the mutants is in frame mutation. FLT3/ITD  mutation is associated with  higher peripheral blood white cell count,   higher percentage of  bone marrow  blast cells  and  lower complete  remission rate, FIT3/IID gene mutation may be used to predict prognosis of patients with AML.

    Key words    FLT3  gene;  internal tandem duplication;  hematologic malignancy

    J Exp Hematol 2007; 15(4):709-713

    FLT3（FMSlike receptor tyrosine kinase）又称胎肝激酶2 (fetal liver kinase 2， FLK2)或干细胞酪氨酸激酶1 (stem cell tyrosine kinase 1， STK)，属于Ⅲ型受体酪氨酸激酶家族［1］。研究表明,17%-34%急性髓系白血病(AML)患者出现FLT3基因内部串联重复(internal tandem duplication，ITD)突变，且与患者预后有关［2］。FLT3/ITD基因突变目前被认为是AML 中发生频率最高的一类突变，且在细胞遗传学正常的患者中发生率高，FLT3/ITD基因突变检测可在一定程度上弥补细胞遗传学检查的不足，因此 FLT3/ITD显现出日益重要的临床价值。本研究对86名连续收治的恶性血液病患者骨髓标本进行了检测，旨在研究FLT3及FLT3/ITD在白血病及各亚型中的表达、分布及其与白血病发生、发展的关系，探索其在白血病预后判断中的应用价值，为临床诊治提供一个有价值的检测和评估新指标，指导临床治疗。

 材料和方法

    研究对象

    86例患者均来自2004年1月-2005年11月我院住院或门诊初治病例，所有患者均经细胞形态学、化学染色确诊，其诊断及疗效标准参照FAB和张之南主编《血液病诊断及疗效标准》［3］。85例中急性髓系白血病(AML)32例，包括M1 1例，M2  3例，M3 7例，M4 10例，M5 10例，全髓细胞白血病1例。AML患者中男18例，女14例，中位年龄45(12-88)岁。急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic  leukemia，  ALL)18例, 急性杂合性白血病（acute hybrid leukemia,  AHL）2例。骨髓增生异常综合征(myelodysplastic  syndrome, MDS) 12例，其中RA 7例，RAEB 5例。慢性粒细胞白血病 (chronic myelogenous leukemia, CML) 10例，其中急变期(CMLBC) 2例。非何杰金淋巴瘤(nonHodgkin′s lymphoma, NHL) 3例，多发性骨髓瘤(multiple  myeloma, MM) 9例，正常对照为10名非恶性血液病查体患者。

    基因组DNA的制备

    采集患者新鲜骨髓标本1.5 ml，应用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，加入STE裂解液，混匀。加入20 mg/ml的蛋白酶K至终浓度为100 μg/ml，混匀，50℃过夜， 以常规酚氯仿法抽提基因组DNA，经紫外分光光度计测定浓度和纯度，保存于-70℃备用。

    引物设计

    根据GenBank中的FLT3基因序列，利用DNA star软件设计对应于14号外显子近端和15号外显子远端的保守序列引物，上游引物P1：5′GCAATTTAG GTATGAAAGCCAGC3′，下游引物P2：5′CTTTCA GCATTTTGACGGCAACC3′。引物由TaKaRa公司合成（PAGE纯化），纯水稀释分装，保存于-20℃。

    PCR扩增

    以上述DNA为扩增模板，经优化选择后，PCR反应体系包括Taq DNA高保真酶1.0 U，2 mmol/L dNTP 3.0 μl，5 pmol/μl上下游引物各0.6 μl，25 mmol/L MgCl2 1.8 μl ，10×PCR反应缓冲液3.0 μl，其余以纯水补足至30 μl。 循环条件为：94℃ 5分钟；94℃ 1分钟；50℃ 1分钟 ；72℃ 1分钟，30个循环；72℃ 10分钟。PCR产物于含溴化乙锭(0.5 μg/ml)的3.0%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。用紫外光透视仪分析图象并照相，出现额外大于野生型FLT3的条带即为ITD阳性产物。

    PCR产物纯化及测序

    取PCR扩增产物300 μl，用3.0%的TBE琼脂糖凝胶分离，与PCR Marker对照无误后，切下特异性扩增条带，按QIA quick PCR纯化试剂盒（Qiagen公司产品）说明书进行操作。将回收纯化的PCR产物克隆在pMD18T载体上（TaKaRa公司产品），碱裂解法提取质粒 15 μl（约为300 ng/μl），寄往上海博亚公司进行测序。将测序结果与野生型FLT3基因序列比较，分析FLT3基因中的ITD序列。

    统计学处理

    率的比较采用卡方检验，均数和标准差比较采用ｔ检验或t′ 检验。

    结    果

    FLT3基因及FLT3/ITD突变的检测

    FLT3基因检测阳性的患者骨髓标本在329 bp出现特异性条带，若FLT3内部存在重复串联结构，则可发现两条特异性条带，即在329 bp上方出现另1条特异性条带（图1）。86例恶性血液病患者FLT3基因及FLT3/ITD突变检测结果见表1。10名非恶性血液病对照FLT3基因检测均为阴性，而32例急性髓细胞白血病患者中27例（84.3%）FLT3阳性，5例（15.6%）FLT3/ITD阳性，在ALL、AHL、CML、CMLBC、MDS、MM、NHL均未检测到FLT3/ITD突变。

    FLT3/ITD测序结果

    对1例FLT3/ITD阴性标本及4例FLT3/ITD阳性标本进行测序分析，其中3例测序成功（图2）。LH11MB为11号病例FLT3阳性条带测序结果(329 bp) ，与GenBank中FLT3全基因序列（U02687，NM004119）100%同源，LH11MB（2）为11号病例FLT3/ITD大于329bp的阳性条带测序结果，目的基因片段测序为391 bp，其ITD长度为63 bp（21aa），位于外显子14，未累及内含子14和外显子15，为框内突变，ITD序列包括2个SH2结合结构域（YEYV与YEYDLK），出现2个氨基酸的替换（Phe→Ile，Glu→Lys）。LH6MB为6号病例FLT3/ITD阳性条带测序结果(355 bp)，其ITD长度为27bp（9aa），亦位于外显子14，亦包括2个SH2结合结构域（YEYV与YEYDLK）。    AML患者FLT3/ITD突变阳性与临床预后的关系

    追踪观察26例FLT3基因表达阳性AML患者治疗后转归情况，5例FLT3/ITD突变阳性组完全缓解(CR)率为40.0%(2/5)，低于FLT3/ITD突变阴性组(66.7%)(14/21)，但无统计学意义(p>0.05)。

    讨    论

    ITD是近年来在AML患者中发现的FLT3基因最常见的一种突变类型。各种类型的FLT3/ITD均表现为非配体依赖性磷酸化，异常激活Ras和STAT 5途径，导致细胞转化。ITD导致FLT3酪氨酸激酶异常激活的机制尚不清楚。Kiyoi等［4］认为，JM结构域突变可能会引起FLT3细胞外C末端区域的构象发生改变，有利于FLT3二聚体的形成，导致非配体依赖性磷酸化。也有学者认为，JM区SH2结合位点的重复与FLT3受体酪氨酸激酶（RTK）活性的增强有关［5］。近年来许多研究表明，17%-34%的AML患者存在FLT3/ITD，可见于 FAB 各亚型，小于5%的MDS患者存在FLT3/ITD，且多为MDS的白血病转化型。而在 ALL 中这种突变则极为少见，且几乎均为具有髓系标志的 ALL，在其它恶性血液病，如：CML（包括 CML 急性变）、CLL、JMML、NHL、成人 T 细胞性白血病、多发性骨髓瘤及实体瘤中均未检测到 FLT3/ITD［2,6,7］。我们的结果显示，AML患者中FLT3/ITD的阳性率为15.6%(5/32)，其中M3和M5患者中FLT3/ITD的阳性率分别为14.3%（1/7）和30.0%（3/10）。在ALL、AHL、CMLBC和12例MDS患者中未检测到FLT3/ITD。

    本实验中，具有 FLT3/ITD 突变的患者在不同 FAB 分型中的分布为：M3、M4 型各 1 例，M5 型 3 例。可看出M4+M5 型占较大比例。Thiede等［6］发现，在 M5 型患者中高达 40％存在 FLT3/ITD 突变。Munoz等［8］也报道，FLT3/ITD 阳性患者在免疫表型上高表达单核系抗原 CD36、CD11b。由于单核细胞分化的整个过程中均会持续表达 FLT3 基因［9］，而且 FLT3 配体在体外诱导培养CD34+细胞向单核细胞定向分化时是一个重要的优化因素。因此，推测突变后引发的 FLT3 持续激活，可能与单核细胞恶性增殖有一定关系。本研究结果同时表明，FLT3/ITD阳性组患者就诊时外周血白细胞数及骨髓原始细胞数显著高于阴性组，这与国外报道一致［2］。由于 FLT3/ITD 突变引发 RTK持续激活，使细胞发生自发性、非受体依赖的增殖，这可能是这种突变患者外周血具有高白细胞的原因，而后者是白血病明确的不良预后因素之一。

    ITD常存在于外显子14，偶尔也出现于内含子14和外显子15，多分布在JM区中从密码子589至599的富含酪氨酸残基的一段区域，以首尾相接顺序插入若干个复制的核苷酸，使JM区延长，而其它结构域不受影响。2002年德国学者两项研究表明，FLT3/ITD长度分别为6-180 bp和3-400 bp［6,7］， 英国和意大利学者亦同时报道了相似的结果［7,10］，2005年Auewarakul等［5］报道14例FLT3/ITD测序结果，每1例ITD序列都不相同，所有ITD序列均包含2-4个酪氨酸残基，同时至少包括1个SH2结合位点（13例包含YEYV，8例包含YEYDLK），而这一位点是原始信号蛋白结合位点，说明JM区SH2结合位点的重复与FLT3受体酪氨酸激酶（RTK）活性的增强有关，其中7例出现氨基酸替换。国内有关FLT3/ITD研究起步较晚，文献报道不多。 2004年王莉红等［11］对5例FLT3/ITD测序分析结果显示，1TD位于外显子14，长度为21-60 bp，3例为单纯串联重复，2例同时出现插入序列，均未改变FLT3阅读框架。我们测序结果表明，ITD位于外显子14,长度为27-63 bp, 为单纯串联重复，FLT3/ITD序列包括2个SH2结合结构域（YEYV与YEYDLK），并出现2个氨基酸的替换，其ITD序列及氨基酸的替换均具有独特性，均未改变FLT3阅读框架。

    目前，绝大部分AML患者缺乏可以早期预测其预后的特异性指标。近期许多研究表明， FLT3/ ITD基因突变阳性患者的预后差［2］。我们的结果显示，15.6%的AML存在FLT3/ITD突变，而且FLT3/ITD阳性组AML患者CR率低于FLT3/ITD阴性组，FLT3/ITD突变阳性AML患者外周血白细胞数及骨髓白血病细胞比例也明显高于FLT3/ITD阴性组，而这2个指标均提示预后差。这说明FLT3/ ITD基因突变可作为预测AML预后的一个指标，有助于患者的治疗。

【参考文献】1Rosnet O， Marchetto S，Delapeyriere O，et al. Murine Flt3，a gene encoding a novel tyrosine kinase receptor of the PDGFR/CSF1 R family. Oncogene，1991;6：1641-1650

2Kottaridis PD， Gale RE， Frew ME， et al. The presence of a FLT3 internal tandem duplication in patients with acute myeloid leukemia (AML) adds important prognostic information to cytogenetic risk group and response to the first cycle of chemotherapy: analysis of 854 patients from the United Kingdom Medical Research Council AML 10 and 12 trials. Blood， 2001; 98:1752-1759

3杨天楹.急性非淋巴细胞白血病.见:张之南，主编.血液病诊断和疗效标准.第2版.北京:科学出版社，1998;171: 183

4Kiyoi H, Towatari M, Yokota S, et al. Internal tandem duplication of the FLT3 gene is a novel modality of elongation mutation which causes constitutive activation of the product. Leukemia. 1998; 12:1333-1337

5Auewarakul CU, Sritana N, Limwongse C, et al. Mutations of the FLT3 gene in adult acute myeloid leukemia：determination of incidence and identification of a novel mutation in a Thai population. Cancer Genet Cytogenet, 2005; 162:127-134

6Thiede C， Steudel C， Mohr B， et al. Analysis of FLT3activating mutations in 979 patients with acute myelogenous leukemia: association with FAB subtypes and identification of subgroups with poor prognosis. Blood， 2002; 99:4326-4335

7Schnittger S，Schoch C，Dugas M，et al. Analysis of FLT3 length mutation in 1003 patients with acute myeloid leukemia：correlation to cytogenetics，FAB subtype ，and prognosis in the AMLCG study and usefulness as a marker for the detection of minimal residual disease. Blood，2002; 100：59-66

8Munoz L， Aventin A, Villamor N, et al. Immunophenotypic findings in acute myeloid leukemia with FLT3 internal tandem duplication. Haematologica， 2003; 88: 637-645

9Rappold I， Ziegler BL， Kohler I， et al. Functional and phenotypic characterization of cord blood and bone marrow subsets expressing FLT3 (CD135) receptor tyrosine kinase. Blood， 1997; 90:111-125

10Noguera NI, Breccia M, Divona M, et al. Alterations of the FLT3 gene in acute promyelocytic leukemia: association with diagnostic characteristics and analysis of clinical outcome in patients treated with the Italian AIDA protocol. Leukemia, 2002; 16:2185-2189

11王莉红, 周春林, 张新伟等.FLT3基因内部串联重复突变与急性白血病的关系及临床意义,中华血液学杂志, 2004; 25:393-396