慢性粒细胞白血病smac和survivin基因表达及意义

作者：王术国，管洪在，扈新花，巩国亭作者单位：青岛大学医学院血液学教研室，山东 青岛 266021 【摘要】  目的 检测慢性粒细胞白血病(CML)病人smac和survivin mRNA的表达情况，以探讨其在CML病情进展及预后中的意义。方法 应用半定量RTPCR技术检测71例CML病人和10名健康者上述基因的表达。结果 smac和survivin mRNA在CML病人的阳性表达率分别为90.1%、63.4%，均明显高于正常对照组（χ2=22.176、6.773,P<0.01、0.05)，二者在CML的加速期、急变期的表达水平明显高于慢性期(t=10.708～16.725,P<0.01)，且二者在CML病人的表达水平呈正相关(r=0.833,P<0.01)。结论 smac和survivin基因与CML的病情进展密切相关，是监测CML病情进展及判断预后的有价值的分子标记物。 【关键词】  白血病，髓样，慢性；基因smac；基因survivin;基因表达　　EXPRESSIONS OF smac AND survivin GENES IN CHRONIC MYELOID LEUKEMIA AND THEIR CLINICAL SIGNIFICANCE　　WANG SHUGUO, GUAN HONGZAI, HU XINHUA, et al　　(Department of Hematology, Qingdao University Medical College, Qingdao 266071, China );　　［ABSTRACT］ObjectiveTo detect the expressions of smac and survivin mRNA in chronic myeloid leukemia (CML) and explore their clinical significance.MethodsUsing semiquantitative RTPCR technique, expressions of smac and survivin mRNA were detected in 71 CML patients and 10 healthy adults.ResultsA positive rate of smac and survivin in the patients was 90.1% and 63.4%, respectively, significantly higher than that of the controls (χ2=22.176,6.773;P<0.01,0.05). Both smac and survivin expressions were much higher in accelerated phase and acute transformation phase than in chronic phase (t=10.708-16.725,P<0.01). The expression level of smac and survivin showed positive correlation (r=0.833,P<0.01).ConclusionThe smac and survivin genes are closely related to the advancement and prognosis of CML, which are valuable molecular markers to be used for monitoring the disease.

    ［KEY WORDS］Leukemia, myeloid, chronic; Gene smac; Gene survivin; Gene expression

    细胞凋亡调控基因与白血病的发生、发展有着密切的关系。survivin作为IAP家族中的一员，起着抑制细胞凋亡的作用。第二个线粒体来源的胱氨酸酶激活剂smac，是目前发现的惟一存在于哺乳动物细胞中能直接拮抗凋亡抑制蛋白家族(IAPs)的蛋白[1]。本文通过检测慢性粒细胞白血病(CML)病人smac和其拮抗素survivin mRNA的表达，旨在从促凋亡和抗凋亡两方面来研究CML白血病细胞基因表达以及其在CML发病中的意义。

　　1  对象与方法

　　1.1  研究对象

    2006～2007年到我院做染色体分析的CML病人71例，男39例，女32例；中位年龄40岁。其中慢性期（CMLCP）54例，加速期（CMLAP）7例，急变期（CMLBP）10例，诊断和治疗标准均符合文献[2]的血液病诊断及疗效标准。以K562细胞株作阳性对照，10名健康人作为正常对照组。

　　1.2  RNA提取

    取骨髓液2 mL加于等量的人淋巴细胞分离液上，以2 000 r/min离心15 min，分离单个核细胞，加入Trizol试剂1 mL，按照试剂说明书进行细胞总RNA提取，使用紫外分光光度计测定RNA纯度(A260/280>1.60)，同时测定RNA浓度。在15 g/L琼脂糖凝胶电泳下可见3条清晰亮带(28 s，18 s，5 s)，说明所提取RNA完整。

1.3  RTPCR检测

　　1.3.1  引物设计

　　survivin、smac引物根据基因序列（NM_001012270、NM_019887）使用primer premier 5.0设计，survivin上游引物：5′CTTGCCAGAGCCACGAAC3′，下游引物：5′GGAACCTCACCCATAGCC3′，扩增产物长632 bp； smac上游引物：5′ATAACCGCCAGGAATCAC3′，下游引物：5′CCAAGGGCTAAGAACCAG3′，扩增产物长381 bp。参考文献[3]合成内参照βactin引物，上游引物：5′AAACACCCCAGCCATGTACGT3′,下游引物：5′GTGGTGGTGAAGCTGTAGC3′,扩增产物长228 bp。引物由上海生工生物技术服务有限公司合成。

　　1.3.2  cDNA合成

　　取1 μg细胞总RNA，加入10 μmol/L特异性目的基因下游引物1 μL，混合后75 ℃水浴5 min，再冰浴5 min，加AMV缓冲液2 μL，25 mmol/L dNTP 0.4 μL,40 U/μL RNAsin 0.4 μL，10 U/L AMV逆转录酶0.33 μL（Bio Basic Inc.）加DEPC水至10 μL，然后42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min。

　　1.3.3  PCR扩增

　　PCR反应体系中含逆转录产物2 μL，10×Taq缓冲液2.0 μL，10 nmol/L上游引物2.0 μL,10 nmol/L下游引物1.8 μL， DNA聚合酶(Taq+Pfu) 2.5 U,补充DEPC水至20 μL。smac 的扩增条件：94 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃延伸60 s。survivin的扩增条件：94 ℃ 45 s，52 ℃ 45 s，72 ℃延伸60 s。actin扩增条件：94 ℃ 45 s，53.6 ℃ 45 s，72 ℃延伸60 s。分别用20、24、28、32、36、40个循环扩增smac、survivin、βactin，绘制反应曲线图，根据其PCR反应的线性范围确定smac、survivin、βactin的PCR循环数分别为27、34、 28。所用试剂由上海生工生物技术服务有限公司提供。

　　1.3.4  PCR产物分析

　　取PCR扩增产物5 μL,于20 g/L琼脂糖凝胶上电泳(85 mV,75 min)后，进行凝胶成像分析，然后以目的基因与内参照βactin的比值进行半定量分析，各标本进行2次，取平均值。

　　1.4  统计学处理

    结果采用SPSS 13.0软件进行统计学处理，分别应用t检验、χ2检验、相关分析等。

　　2  结 果

　　2.1  smac和survivin在CML中的表达

    smac、survivin在CML的阳性表达率明显增高，和正常对照比较均有显著性差异（χ2=22.176、6.773，P<0.01、0.05），survivin在CMLCP的阳性表达率与CMLAP、CMLBP比较均有显著性差异（χ2=5.874、8.109，P<0.05）,smac在CML 3期中阳性表达率差异均无统计学意义（χ2=2.455，P>0.05）。smac、survivin在CML 3期的表达水平和正常对照比较差异均有显著性(t=3.07～28.92,P<0.01)。smac、survivin在CMLCP的表达水平和CMLAP、CMLBP表达比较有显著性差异(t=10.708～16.725， P<0.01)。二者在CMLAP的表达水平与CMLBP比较均无统计学意义(P>0.05)。见表1、图1。 表1  smac、survivin mRNA在CML中的半定量表达组别nsmac mRNA阳性率(略)

　　2.2  smac和survivin在CML中表达的相关性

    二者在CML中的表达水平呈正相关关系(r=0.833,P<0.01)。见表1。

　　2.3  smac、survivin表达与外周血WBC计数关系

    将CML病人按白细胞计数是否大于10×109/L分为高白细胞组和低白细胞组，前者两种基因的阳性表达率均明显高于后者（χ2=7.136、4.458，P<0.05），表达水平也明显高于后者（t=4.952、3.726，P<0.01）。见表1。

　　2.4  smac、survivin表达与贫血的关系

    将CML病人按是否贫血（男<120 g/L,女<110 g/L）分为贫血组和非贫血组，前者两基因的表达水平明显高于后者（t=2.106、3.698，P<0.05、0.01）。二基因在两组中阳性表达率均无显著性差异（χ2=0.043、1.004，P>0.05）。见表1。

2.5  smac、survivin表达与不同治疗方案的关系

    将CML病人按正接受的不同治疗方案分为羟基脲（HU）组、干扰素联合阿胞糖苷（IFNAraC）组、甲磺酸伊马替尼（STI571）组，smac、survivin在3组阳性表达率均无显著性差异(P>0.05)。smac  在3组表达水平无显著性差异(P>0.05),而survivin在STI571组表达水平明显低于HU组和IFNAraC组（t=2.719、3.085，P<0.05）。见表1。

　　3  讨论    smac是近年来发现的一种存在于线粒体的促凋亡蛋白质，当细胞发生凋亡时，它与细胞色素C一同释放到胞浆中，通过两种不同的方式来激活caspase，从而促进凋亡的发生。第一,它可以直接与Apaf1、cytoc和caspase9作用，增强caspase的激活效应。第二,smac可以通过N端序列结合多种IAP分子（cIAP1、cIAP 2、XIAP 和survivin），去除IAPs的抑制作用，从而促进caspase9的激活。survivin是IAPs的重要成员，是迄今发现的最强的凋亡抑制因子，survivin能通过多种途径发挥抑制凋亡作用，途径之一就是survivin与smac结合解除smac对其他IAP成员的抑制作用，间接发挥抗凋亡作用。有研究表明，survivin高表达于各种人类肿瘤组织和大部分血液系统恶性肿瘤，survivin 的阳性表达率随组织分化程度降低而增强，随临床病理分期增加而增强，并与疾病的发展、预后等密切相关[4]。本研究应用RTPCR的方法检测了K562细胞株和71例CML病人smac、survivin mRNA的表达，结果表明二者在K562细胞株和CML 3期中均有表达，其中smac在3期表达率虽无差别，但在表达水平上却出现了量的显著差异，二者在加速期、急变期都呈现出高表达水平，明显高于慢性期。此外，分析smac和survivin表达与病人临床表现的关系显示，外周血高白细胞计数的病人和有贫血症状的病人smac和survivin表达明显增高。以上结果都说明，二者和CML的病情进展密切相关，随着疾病的进展基因表达水平升高，二者水平一定程度上也反映了白血病细胞恶性增殖程度以及白血病细胞的高负荷状态，因此对二基因进行联合检测有助于CML病人的病情监测和预后评估。

    童强松等[5]研究表明，smac、caspase3随神经母细胞瘤（NB）临床分期的增加、分化程度的降低，表达率依次降低。GUIYI等[3]研究表明，smac 在膀胱癌上皮细胞中的表达随着疾病进展而降低。包仕廷等[6]研究显示，肝癌组织中smac与survivin 的表达呈显著负相关。与以上研究不同的是，本研究显示CML病人smac与survivin在CML的表达呈显著正相关。smac与survivin的表达在不同肿瘤细胞表现出的差异,说明二者在肿瘤中的表达具有一定的细胞特异性。在白血病细胞中smac 对survivin 可能是正反馈调节, survivin 表达的增加通过某种信号转导直接或间接引起smac mRNA转录增强,翻译出更多的smac蛋白以拮抗survivin的抑凋亡作用，但smac的高表达还不足以中和survivin的影响，促凋亡和抗凋亡两方面因素间力量依然失衡致使疾病继续发展,两者关系可能是CML白血病细胞凋亡信号传导网络中的重要一环。

    STI571是一种分子靶向药物，是信号转导阻滞剂，可用于治疗CML，因它能与ATP竞争结合位于酪氨酸蛋白激酶（PTK）催化中心的结合位点，阻止酪氨酸残基磷酸化，从而抑制酪氨酸激酶磷酸化，可使bcrabl融合基因编码的P210蛋白的酪氨酸蛋白激酶活性降低，从而抑制CML细胞增生。本研究按照病人正在接受的治疗方案不同进行分组比较显示，正在接受STI571治疗的病人survivin表达水平明显低于其他治疗组，而smac在各治疗组间表达水平差异无统计学意义。提示survivin基因表达可能受bcrabl融合基因调节，其机制可能是STI571引起P210蛋白酪氨酸激酶活性降低，导致白血病细胞增殖、分化受抑，从而诱导了survivin基因表达下调。而smac不受bcrabl融合基因调节依然处于正反馈调节的高表达水平，这也有助于白血病细胞凋亡的增加。

【参考文献】  　　[1]VERHAGEN A M, EKERT P G, PAKUSCH M, et al. Identification of DIABLO, a mammalian protein that promotes apoptosis by binding to and antagonizing IAP proteins[J]. Cell, 2000,102(1):4353.

　　[2]张之南,沈悌. 血液病诊断及疗效标准[M]. 第2版. 北京：科学出版社,1998:219228．

　　[3]GUIYI L, FUQING Z. Detection of Smac expression in bladder cancer and its clinical significance[J]. 南京医科大学学报:英文版, 2006,20(1):4851.

　　[4]王东升,周岩冰,王海波. Survivin及P53蛋白在胃癌组织中的表达[J]. 青岛大学医学院学报, 2005,41(4):302303.

　　[5]童强松,郑丽端,阮庆兰,等. Smac和Caspase3基因在神经母细胞瘤中的表达及其临床意义[J]. 中国癌症杂志, 2004,14(1):9091.

　　[6]包仕廷,桂水清,林木生,等. Smac和Survivin基因在肝癌中的表达及与细胞凋亡的关系[J]. 中华实验外科杂志, 2005,22(9):10621063.