套层细胞淋巴瘤细胞系中染色体13q31q32上miR1792基因簇的DNA序列研究

作者：徐卫，李建勇，沈秋丹，李丽，于慧    作者单位：南京医科大学第一附属医院、江苏省人民医院血液科，南京 210029

【摘要】  为了研究B细胞淋巴瘤的染色体13q31q32上miR1792基因簇的特点，观察B细胞淋巴瘤中miR1792基因簇在基因组DNA水平上是否存在改变，及其对miR1792基因簇的表达和与淋巴瘤发生关系的影响。应用PCR和DNA序列测定技术检测Rec1、G519和Z138三个套细胞淋巴瘤（mantel cell lymphoma，MCL）细胞系中染色体13q31q32上miR1792基因簇。结果表明，3个MCL细胞系的miR1792基因簇DNA序列与正常人的序列比对完全一致。由此可以认为，MCL细胞系中miR1792基因簇在DNA序列上没有异常改变，不是miR1792基因簇的过度表达原因。

【关键词】  淋巴瘤

    DNA Sequencing of miR1792 Cluster at Chromosome 13q31q32 in Mantel Cell Lymphoma Cell Lines

    XU Wei, LI JianYong, SHEN QiuDan，LI Li, YU Hui

    Department of Hematology, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Jiangsu Province Hospital, Nanjing 210029, China

    Abstract    This study was aimed to explore the characteristics of miR1792 cluster at chromosome 13q31q32 in B cell malignant lymphoma and to investigate the changes of miR1792 chuster in B cell lymphoma at genome DNA level and its influeuce on expression of miR1792 cluster and relation with lymphoma occurence.  PCR and DNA sequencing were used to detect miR1792 cluster at chromosome 13q31q32 in mantel cell lymphoma (MCL) cell lines Rec1, G519 and Z138. The results showed that DNA sequence of miR1792 cluster at chromosome 13q31q32 in MCL cell lines were normal. It is concluded that  there is no abnormal change in DNA sequence of miR1792 cluster which  is not the mechanism for miR1792 cluster overexpression in mantel cell lymphoma cell lines.

    Key words    miRNA; miR1792 cluster; lymphoma

    J Exp Hematol 2007; 15(5):986-988

    微小RNA(miRNA)是一种大小19-25个核苷酸组成的单链小分子RNA，由具有发夹结构的70-90个碱基的单链RNA前体经过切酶(Dicer)加工后生成［1］。miRNA在线虫、果蝇、小鼠和人等多个物种中被广泛发现，在人类已经发现有300多种miRNA，这些普遍存在的小分子在真核基因表达调控中有着广泛的作用。人类染色体13q31q32上存在5个miRNA的前体(miR91precursor13 miRNA、miR18 precursor13 miRNA、miR19aprecursor13 miRNA、miR19bprecursor13 miRNA和miR92precursor13 miRNA)和7个成熟miRNA (miR17、miR91、miR18、miR19a、miR20、miR19b和miR92)的miR1792基因簇，而比较基因组杂交（CGH）研究结果显示，B细胞淋巴瘤，尤其是套层细胞淋巴瘤（mantel cell lymphoma，MCL）（包括MCL细胞系Rec1）染色体13q31q32区域有扩增［2］。为进一步了解其在DNA序列上miR1792基因簇的改变，我们应用PCR和DNA序列测定技术对3个MCL细胞系中染色体13q31q32上miR1792基因簇进行研究。

    材料和方法

    细胞系

    MCL细胞系  Rec1、G519和Z138，均由英国Leicester大学Martin Dyer教授惠赠。此3种细胞

    基金项目：“江苏省医学领军人才”项目资助和江苏省自然基金资助项目，编号BK2007249

    通讯作者：李建勇，主任、主任医师. 电话：（025）83718836-6550.传真：（025）83718836-6260. Email: lijianyonglm@medmail.com.cn

    2007-03-26 收稿；2007-07-12 接受

    系均存在t(11;14)(q13;q32)异常。

    Rec1细胞的核型  43,XY,del(2)(q14q35), der(7)dup(7)(p22)inv(7)(p12q21), t(3;8)(q24;p11),i(8)(p10),t(9;22)(p11;q11),t(9;?17)(q23;q?11),t(11;14)(q13;q32),der(12)t(8;12) (p13;q11),15,17,22,add(22)(q13)。

    中国实验血液学杂志  J Exp Hematol 2007; 15(5)套层细胞淋巴瘤细胞系中染色体13q31q32上miR1792基因簇的DNA序列研究G519细胞的核型  43,XX,der(1)(14qter→14q11::1p34→1p21:: 1q10→1q12::12q12→12q23),der(9)(9q31→9q34::12q23→12q11::9p11→9qter),t(11;14)(q13; q32),12,der(13)(14q32→ 14q24::13q14→13q10::13q10→13qter),14,dic(17;18)(q10;q10),trp(18) (q11q23),der(20)t(17?;20)(q21;p11)。

    Z138细胞核型  51,XY,+der(1)t(1;15)(p11;q11), +der(7)del(7) (q32),t(8;14)(q24;q32),der(11)del(11)(q14q25),t(11;14)(q13;q32)+del(12)(q22q24),+13,t(14;18) (q32;q21),i(17)(q10),+der(18)t(14;18)(q32;q21)。

    采用10%胎牛血清RPMI 1640培养液，于37℃、5% CO2及恒定湿度条件下培养。采用LNS缓冲液裂解细胞，经碘酚抽提法提取DNA。

    miR1792基因簇的PCR扩增

    miR1792基因簇全长约737 bp，为便于DNA序列测序，设计两对引物进行PCR扩增，两PCR产物末端有部分重叠。下列为miR1792基因簇序列图，深色斜体为miR1792基因簇：

    第1对引物，上游：5′TCAAAGTGCTTACAG TGCAGGT3′；下游：5′CCAGGCAGATTCTAC ATCGAC3′。扩增产物大小为426 bp。

    第2对引物，上游：5′CTGATGGTGGCCTGC TATTT3′；下游：5′ACAGTGGAAGTCGAAATCT TCAG3′。扩增产物大小为496 bp。

    两对引物进行PCR扩增的反应体系为50 μl：DNA模板1 μl，10×PCR缓冲液5 μl，25 mmol/L MgCl2 4 μl，10 mmol/L dNTP 1 μl，各引物（10 μmol/L）1 μl，Taq DNA聚合酶1 U。

    扩增条件为：94℃ 2分钟；94℃1 分钟，58℃ 1 分钟，72℃ 1 分钟，共32个循环；72℃ 10 分钟，4℃保存。

    不加DNA模板为空白阴性对照，正常人胎盘组织为阳性对照。

    DNA序列测定

    扩增后的产物采用QIAquick Gel Extraction kit（Qiagen公司产品）进行纯化，然后对纯化的DNA扩增产物进行DNA序列测定。

    结    果

    PCR扩增miR1792基因簇

    MCL细胞系Rec1、G519和Z138的DNA经两对引物PCR扩增后分别在426 bp和496 bp处可见清晰的阳性条带（附图）。

    DNA序列测定

    PCR扩增产物经胶纯化后进行序列测定，序列结果进行序列比对（http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）与正常人染色体13q31q32上miR17簇的序列完全一致，未见异常变化，说明MCL细胞系Rec1、G519和Z138的DNA序列测定miR17簇在基因组DNA水平上的没有异常改变。讨    论

    真核生物中存在两种非编码RNA（noncoding RNA），一类为小干扰RNA（siRNA），另一类为微小RNA(miRNA)。miRNA的主要功能是调节生物体生长、发育和疾病发生过程中有关基因的表达［3］。miRNA对目标靶基因进行转录后调节，它们通过依赖于miRNA和靶基因的互补性的两种不同的机制反向调控靶基因的表达［4，5］。

    miRNA可视为潜在的原癌基因或肿瘤抑制物［6，7］。在弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）、滤泡淋巴瘤（follicular lymphoma，FL）和MCL等肿瘤中常有13q31q32位点的扩增。而在这一扩增区域的唯一的基因就是一个非编码蛋白的RNA：C13orf25，这个转录本编码了miR1792基因簇，其中包含了miR91、miR17、 miR18、miR19a、miR20、miR19b和miR92这7个miRNA［2］。He等［8］运用基因芯片技术，发现前体miR1792簇和成熟miR1792簇在B细胞淋巴瘤患者样本和细胞系中均过度表达，推测miR1792基因簇过度表达与淋巴瘤的发生、发展有关。O′Donnell等［9］证明,miR1792基因簇是一组可能的肿瘤相关的基因，发现Myc诱导了miR1792的表达，在Myc存在的情况下，miR1792基因簇中的miRNA限制了E2F1的活性，通过阻断Myc和E2F1的正反馈循环削弱了Myc对于细胞增殖的影响。miR1792基因簇所起的作用是抑癌基因的作用，这与He等［8］人的发现是相反的。

    miR1792基因簇的抑癌基因和癌基因的多重特点表明了肿瘤发生的复杂性和miRNA调控基因表达的复杂性。CGH研究结果显示,B细胞淋巴瘤，尤其是MCL，染色体13q31q32区域有扩增。为进一步了解MCL中miR1792基因簇在基因组DNA序列上是否存在改变，从而影响miR1792基因簇的表达和与MCL发生的关系，我们应用PCR和DNA序列的测定技术对3个在13q31q32位点的扩增MCL细胞系中miR1792基因簇进行了研究，结果发现Rec1、G519和Z138 3个MCL细胞系的miR1792基因簇DNA序列与正常人染色体13q31q32上miR1792基因簇的序列完全一致，没有异常改变，基因组DNA序列不是miR1792基因簇的过度表达的原因，有关这方面的实验结果，未见国外的相关报道。关于miR1792基因簇在B细胞淋巴瘤发病机制中的作用有待进一步研究。

    近年来miRNA在恶性疾病中的作用引起研究者极大的关注，一些特异的miRNA表达与肿瘤密切相关，随着研究的深入，miRNA在肿瘤发病机理方面的作用将被进一步阐明，将为肿瘤的治疗开辟一条新的途径。

【参考文献】1徐卫, 李建勇, 陆凤翔. 微小RNA及其在恶性淋巴增殖性疾病中的研究进展. 中国实验血液学杂志,2006;14:840-844

2Ota A, Tagawa H, Karnan S, et al. Identification and characterization of a novel gene, C13orf25, as a target for 13q31q32 amplification in malignant lymphoma. Cancer Res,2004;64:3087-3095

3Krek A, Grun D, Poy MN, et al. Combinatorial microRNA target predictions. Nat Genet, 2005; 37: 495-500

4Chen PY, Meister G. microRNAguided posttranscriptional gene regulation. Biol Chem, 2005; 386:1205-1218

5Thomson JM, Newman M, Parker JS, et al. Extensive posttranscriptional regulation of microRNAs and its implications for cancer. Genes Dev, 2006; 20:2202-2207

6Zhang B, Pan X, Cobb GP, et al. microRNAs as oncogenes and tumor suppressors. Dev Biol, 2007; 302:1-12

7Kent OA, Mendell JT. A small piece in the cancer puzzle: microRNAs as tumor suppressors and oncogenes. Oncogene, 2006; 25:6188-6196

8He L, Thomson JM, Hemann MT, et al. A microRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature, 2005; 435（7043）:828-833

9O′Donnell KA, Wentzel EA, Zeller KI, et al. cMycregulated microRNAs modulate E2F1 expression. Nature, 2005; 435（7043）:839-843