急性白血病DNA倍体、合成期细胞百分比及增殖指数的研究
发表时间：2009-06-26 浏览次数：829次
作者：杨芝红，魏军，杨宝珍
作者单位：宁夏医学院附属医院医学实验中心，银川 750004
【摘要】 目的 观察急性白血病患者骨髓或外周血DNA倍体的变化规律。方法 采用流式细胞仪和DNA检测试剂盒检测急性白血病患者DNA倍体、合成期细胞百分比(SPF)、增殖指数(PI)并与DNA倍体分析对照组进行比较。结果 52例急性白血病(AL)中，28例为二倍体，22例为异倍体，2例为可疑异倍体，异倍体检出率为42.3%，22例异倍体(1例近二倍体，5例四倍体，4例多异倍体和12例非整倍体)中，8例为急性淋巴细胞白血病(ALL)，11例为急性髓系白血病(AML)，3例混合细胞性白血病。ALL与AML异倍体检出率分别为42.1%(8/19)和36.7%(11/30)。异倍体组与二倍体组及与对照组两两比较，P＜0.05或＜0.01，差异具有统计学意义。结论 DNA倍体分析可为急性白血病的临床诊断提供客观的实验室依据。
【关键词】 急性白血病；DNA倍体；合成期细胞百分比；增殖指数；流式细胞仪
A Study on DNA Ploidy，S-phase Fraction and DNA Index in Acute Leukemia
(The laboratory Center of the Affiliated Hospital to Ningxia Medical College, Yinchuan 750004)
Abstract： Objective To explore the changing of DNA ploidy in patients with acute leukamia. Methods Immunophenotype and DNA ploidy of the bone marrow and peripheral blood samples was analyzed by means of the flow cytometer with 3-color fluorescence. Results Of 52 AL patients, 28 were patients with diploid, 22 were patients with heteroploid and 2 were patients with suspected heteroploid. The prevalence of heteroploid in AL patients was 42.3%. Of 22 patients with heteroploid, 8 were patients with ALL, 11 were patietns with AML and 3 were the mixed. The prevalence of heteroploid in ALL and AML were 42.1% and 36.7%, respectively. Conclusion Heteroploid group with diploid group and control group, DI, SPF and PI in diploid group and heteroploid were significantly higher than those in control group. Conclusions Immunologic determination is a necessary methods for diagnosis in acute leukemia. Immunophenotype and DNA ploidy could give a scientific laboratory basis for diagnosis, selection of treatment and prediction of prognosis.
Key words： acute leukemia; DNA ploidy; S-phase fraction;proliferation index; flow cytometer
细胞生物学研究证实，细胞分裂最重要的物质基础是DNA的复制，正常细胞核DNA的含量相当稳定，细胞增殖以DNA的倍增为基础。恶性肿瘤的重要特征之一就是细胞无限制地增生，在形态学上表现为细胞核增大，核内染色质增多，这是核内DNA不断复制的结果。国内外大量病理和临床资料已证明，检测恶性肿瘤细胞DNA含量与倍体已成为目前研究肿瘤生物学特性及判断患者预后的热点问题，测定和分析细胞核DNA倍体类型在判定肿瘤的恶性程度、选择治疗方案及评估患者预后方面均具有重要价值。本研究通过对52例AL患者骨髓或外周血进行DNA倍体的研究，观察其DNA倍体的变化规律。
1 资料与方法
1.1 研究对象
52例急性白血病为2005年1月-2006年12月我院血液内科和儿科住院病人，男30例，女22例，年龄2～76岁。FAB分型：ALL 23例，急性非淋巴细胞白血病(ANLL)24例，急性白血病类型待定4例，混合细胞型1例。DNA倍体分析对照组10例，为正常人外周血，男7例，女3例，年龄19～54岁。
1.2 仪器与试剂
仪器为美国BD公司的FACSCaliber流式细胞仪(FCM)。DNA检测试剂盒CycleTESTTM PLUS DNA REAGENT KIT(Lot No 03425包括3瓶缓冲液及试剂A：胰蛋白酶、四氢氯化精氨去污剂；试剂B：胰蛋白酶抑制剂、RNA酶、柠檬酸盐缓冲液、四氢氯化精胺；试剂C：PI染液、四氢氯化精胺、柠檬酸盐缓冲液)，以上试剂均为美国BD公司产品。ISOTONR III稀释液(贝克曼库尔特实验系统苏州有限公司生产)。Lymphocytes separation medium淋巴细胞分离液(上海恒信化学试剂有限公司生产)。
1.3 实验方法
将EDTA抗凝的骨髓或外周血经淋巴细胞分离液离心后，吸取单个核细胞层，经洗涤，调整细胞浓度为1×106/mL，加入A液250μL混匀，室温放置10 min，加入B液200μL，混匀，室温放置10 min，加入C液200μL，混匀，4℃冰箱放置10 min，上流式细胞仪检测。
1.4 骨髓或外周血细胞DNA倍体分析数据的获取
用Cellquest软件设置DNA倍体分析数据获取模式，然后依次上样获取，每管获取细胞数20000个。
1.5 骨髓或外周血细胞DNA倍体及细胞增殖活性数据的分析
用ModFit分析软件对获取数据进行分析，计算DI值，G0/G1期、S期、S+G2/M期比值，依据DI值判定DNA倍体［1］。把近二倍体、多倍体、四倍体、非整倍体均划为异倍体的范畴。细胞增殖活性以合成期细胞百分比(SPF)和增殖指数(PI)表示：SPF=〔S÷(G0/G1+S+G2/M)〕×100%，PI=〔(S+G2/M)÷(G0/G1+S+G2/M)〕×100%。
1.6 统计学方法
多样本均数间比较采用One-way ANOVA检验，组间的两两比较采用Student-Newman-Keuls检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 DNA倍体分析及细胞周期分布
52例AL中，28例为二倍体，22例为异倍体，2例为可疑异倍体，异倍体检出率为42.3%。22例异倍体中，包括1例近二倍体，5例四倍体，4例多异倍体(DNA直方图中明显可见两个异倍体峰)和12例非整倍体。22例异倍体中8例为ALL，11例为AML，3例混合细胞性白血病。ALL与AML异倍体检出率分别为42.1%(8/19)和36.7%(11/30)。
2.2 异倍体组、二倍体组及正常对照组细胞周期时相分布(表1)表1 50例急性白血病细胞周期时相分布(略)
2.3 异倍体组、二倍体组及正常对照组DI值、SPF及PI结果(表2)表2 异倍体组、二倍体组及正常对照组DI值、SPF及PI结果(略) 经方差分析，DI、SPF及PI在各组间差异均有统计学意义(P＜0.01)，异倍体组与二倍体组及对照组两两比较，除二倍体组与正常对照组SPF比较P＜0.05外，其它DI、SPF及PI均P＜0.01，差异具有统计学意义。
3 讨论
随着流式细胞仪在临床医学中的广泛应用，大量研究表明，DNA倍体、SPF及PI的异常能反应肿瘤的恶性程度及生物学行为。正常细胞均具有恒定的DNA二倍体含量，DNA含量随着细胞增殖周期各时相而发生变化。细胞增生周期的4个时相为G1期、S期、G2期、M期和非增生状态的G0期细胞。
细胞在非增殖状态下DNA含量稳定，为二倍体，以2C表示，当细胞进入分裂期，DNA含量增加，在DNA合成后期，即G2期，DNA含量倍增，达4C，而在DNA合成期，即S期，DNA含量介于2C～4C之间。在病理状态下，尤其是癌变的细胞，染色体的结构和数目发生异常，使细胞DNA含量也随之改变，出现DNA异倍体，如3C、5C等，故测定细胞核DNA含量可以判别细胞的增殖状态。肿瘤细胞在增殖分裂过程中出现DNA合成的丢失或不分离，而产生了DNA异常的细胞群，即出现DNA异常的干系(克隆)，这种DNA异常干系，即称为DNA异倍体。DNA异倍体提示肿瘤细胞增殖旺盛，肿瘤恶性程度、肿瘤的复发率、转移率和死亡率高，预后不良［2-3］。在不同疾病或同一疾病的不同类型中，异倍体检出率不同，如急性白血病为20%～50%，实体瘤为70%～80%，且有研究表明，急性淋巴细胞白血病检出率高于急性非淋巴细胞白血病［4］。本研究52例急性白血病中，异倍体22例，异倍体检出率为42.3%，ALL与AML异倍体检出率分别为42.1%(8/19)和36.7%(11/30)，ALL检出率高于AML，与报道相符。22例异倍体中，1例亚二倍体(DI=0.78)，5例四倍体(DI值分别为2.07、2.04、2.08和2.05)，4例多异倍体(DNA直方图中可见明显的两个异倍体峰)和12例非整倍体。王卫等［5］报道，白血病异倍体以超二倍体(DI＞1.1)为主，且均为单倍体，未见两种倍体混合存在。本研究中超二倍体20例，与其报道相符，但本研究的20例超二倍体中4例为多异倍体，且其中2例多异倍体FCM免疫分型为混合细胞白血病。
S期为细胞的DNA合成期，SPF、PI作为肿瘤细胞增殖活性的指标，一般认为肿瘤细胞S期比率高，肿瘤细胞增殖旺盛，则细胞倍增时间短，肿瘤发展快［3］。本研究中，异倍体组SPF、PI值显著高于二倍体组与对照组，与二倍体组及对照组比较，均P＜0.01，差异具有统计学意义，说明异倍体组与二倍体组白血病之间存在明显的增殖能力的差别，异倍体组的增殖能力明显高于二倍体组，即DNA为异倍体的白血病病人白血病细胞恶性程度较高、参与增殖的细胞较多且细胞倍增时间短、白血病细胞增殖较旺盛。本研究中二倍体组白血病与正常对照组比较，DI、SPF及PI均 P＜0.01，差异也具有统计学意义，说明即使DNA为二倍体的白血病病人，其体内还是存在一定量的白血病细胞，其DI、SPF及PI也不同于正常人，即二倍体细胞有正常细胞的DNA含量，但不除外染色体异常。在FCM DNA检测中，只有染色体数目的变化带来DNA含量差异可被检测时，才可能有DNA异倍体的检出。本研究中2例可疑异倍体，在其DNA直方图中，无明显的非整倍体细胞峰，但可见一个突出的四倍体细胞峰，且其S期细胞为13.52%和14.15%，因此为可疑异倍体，在临床中对可疑异倍体病人进行再次检查是必要的。
综上所述，DNA倍体分析可为急性白血病的临床诊断提供客观的实验室依据。
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［5］王卫，刘云鹏，卢香兰，等.DNA含量的流式细胞仪检测在判断急性淋巴细胞白血病预后中的意义［J］.白血病.淋巴瘤，2003，12(1)：21-23.
