自体骨髓干细胞移植对老年下肢缺血疾病的疗效

作者：吕晓霞 尹至 金 星 吴学君 侯向前 李亚南2    作者单位：(山东大学附属省立医院，山东 济南 250021)

【摘要】  目的 评价干细胞移植治疗慢性下肢缺血的临床疗效及相关影响因素。方法 应用自体骨髓干细胞移植治疗34例老年慢性下肢缺血患者。其中下肢动脉硬化闭塞症27例，糖尿病足7例。用梯度密度法分离骨髓干细胞，制备干细胞悬液。直接注射至患肢肌肉内。结果 患肢疼痛、麻木感和冷感觉改善率为79.41%，术后第1天患者即反映患肢不适感好转。出院时,27例患者静息痛消失或明显减轻，3例患者跛行距离由不足50 m提高到大于100 m，6例伴有溃疡患者，溃疡愈合或面积逐渐减小，6例踝肱指数(ABI)增加大于0.1，4例足趾坏疽患者中：1例症状明显缓解，静息痛消失，行坏疽足趾切除，愈合良好，2 例疼痛消失，睡眠改善，坏疽组织有脱落迹象，1例于膝下截肢时被截除。结论 干细胞移植治疗慢性下肢缺血，方法安全、简单、有效。尤其是对于下肢动脉没有流出道的患者,可使一部分患者免除截肢或降低截肢平面,改善生活质量。

【关键词】  自体骨髓干细胞移植;下肢缺血;治疗性血管生成

Therapeutic effect of autologous bone marrow stem cells transplantation on aged patients with chronic ischemia of lower limb

　　Lü XiaoXia, YIN Zhi, JIN Xing, et al.

　　Department of Vascular Surgery, Shandong Provincial Hospital, Ji′nan 250001, Shandong, China

　　【Abstract】 Objective To evaluate the effect of autologous on bone marrow stem cells (BMSC) transplantation in aged patients with chronic ischemia of lower limb and explore relative influence factors. Methods 34 aged patients with chronic ischemia of lower limb were treated with autologus BMSC transplantation, including 27 cases of atherosclerosis obliteran (ASO), 7 cases of diabetic feet. BMSC were isolated with density gradient centrifugation and were intramuscularly injected into the suffered limbs. Results The symptoms of pain, paresis, and coldness were improved by 79.41%. The rest pain of 27 paitents diminished or relieved obviously. The distance of intermittent claudication was increased from less than 50 m to more than 100 m in 3 patients. The ulcers of 6 patients healed up or reduced in size. The ankle brachial index (ABI) increased by more than 0.1 in 6 patients. Among the 4 patients with toes gangrene, 1 patient got rid of the rest pain and had a good wound healing after the gangrenous toes resection, 2 patients got rid of the pain and the gangrenous tissue began to exfoliate, 1 patient was subjected to a belowknee amputation. Conclusions The autologus BMSC transplantation is a safe, simple and effective approach of cellular therapy for chronic ischemia of lower limb, especially for the patients without outflow.

　　【Key words】 Autologus bone marrow stem cell (BMSC) transplantation; Lower limb ischemia; Therapeutic angiogenesis

　　难治性下肢缺血性疾病，是临床常见的棘手问题，具有高发生率、高致残率和高死亡率的特点，传统的治疗方法包括手术、介入和药物治疗，但对远端动脉狭窄闭塞、流出道条件差的病人效果不佳,并且此类病人多为体弱高龄,手术风险大。治疗性血管生成〔1〕是近年被提出的一项新理念，依据干细胞具有多种分化潜能，并能够提供各种成血管细胞因子的原理，将患者自体的干细胞分离出来，种植到缺血部位，生成新的毛细血管网。用骨髓干细胞(BMSC)自体移植治疗缺血性疾病在世界范围内尚属于试验阶段，缺少大规模的临床经验。本文利用骨髓干细胞自体移植治疗下肢缺血性疾病，获得了良好疗效，研究过程遵循全国细胞学组自体细胞移植要求的程序，经山东省立医院伦理委员会批准，现具体报道如下。

　　1 资料与方法

　　1.1 资料 ①自2004年9月至2007年9月，选择下肢血管缺血性病变失去外科手术或介入治疗适应证并愿意接受干细胞移植的患者34例，男23例，女11例，年龄60～83(平均69)岁。患者诊断分别为下肢动脉硬化闭塞症(ASO)27例，糖尿病足7例。全部患者均有足部和(或)下肢发凉、麻木、疼痛、间歇性跛行。发展到静息痛27例，伴皮肤溃疡6例，伴足趾坏疽4例，合并感染7例，2例一侧肢体已行截肢手术。34例中合并高血压31例，冠心病26例，糖尿病17例，血脂异常32例。2 例曾经行血管内支架置入术，术后再次闭塞或严重狭窄。②辅助检查:34例病人均经下肢血管彩色多普勒、CTA和(或)动脉造影检查，股浅动脉、股深动脉狭窄或者闭塞29例，腘动脉狭窄或者闭塞26例，34例均有不同程度的胫前动脉、胫后动脉或腓动脉狭窄或者闭塞。③临床评分标准:参考国内学者所提出的下肢缺血严重程度分级〔2〕，将所有患者均根据怕冷程度、麻木感、疼痛程度、间歇性跛行距离、溃疡情况、有无感染、及踝肱指数(ABI)等指标进行临床评分。评分标准见表1。

　　1.2 移植方法 ①术前骨髓评估：移植前进行骨髓像评估，术前先抽取1 ml做骨髓涂片以排除血液病，本组发现2例骨髓增殖减低，应用粒、单核细胞集落刺激因子，4 d后复查明显好转。②单个核细胞的获得：病人取俯卧位，接好床旁心电血压监护设备。常规消毒，铺洞巾。用1%的利多卡因分别在双侧的髂后上棘部位作局部麻醉。骨穿针被髂骨所固定后抽取骨髓，先抽取1 ml肝素盐水再抽取9 ml的骨髓血。使用多侧孔骨髓穿刺针，多点多方向抽取，这样可以抽取更多的骨髓细胞。抽取自体骨髓300～400 ml，贴壁注入无菌骨髓保养袋中混匀。在体外经过人间充质干细胞分离液处理，此试剂购自天津市灏洋生物制品公司。离心后，提取单个核细胞层，根据所需体积稀释成单个核细胞悬液。③干细胞鉴定： 对分离的BMSC进行体外培养鉴定，结果：在DMEM培养基中贴壁生长(图1);对所获得的细胞进行表面标志，流式细胞仪分析具有:HMSC独特的表型特征,即CD29、CD44阳性和CD34、CD45阴性。④干细胞移植：硬膜外麻醉下，根据缺血范围选取缺血肢体大腿中下段及小腿部前、后、外肌群肌肉注射，每次每个穿刺点注入0.5 ml，间隔1 cm，多点穿刺注射。术后7～10 d出院。表1 患者缺血情况评分表

　　1.3 疗效评估 比较34例患者移植前与移植后缺血情况临床评分(取每个患者移植后7 d、2 w、1、3、6月的最低临床评分)的差异。

　　1.4 统计学处理 临床评分用x±s表示，采用SPSS 11.5统计软件包进行自身配对t检验。

　　2 结 果

　　2.1 缺血改善情况 抽取骨髓过程中，除1例出现乏力外，其余均无异常感觉，乏力者第2天好转。干细胞移植过程顺利，分离的单个核细胞计数为0.038×108～8.6×108。术后第1天患者均反映患肢不适感好转。出院时27例(79.41%)患者静息痛、麻木感和冷感消失或明显减轻，3例患者跛行距离由不足50 m提高到大于100 m，6例伴有溃疡的患者，溃疡愈合或面积逐渐减小。6例ABI增加大于0.1，其他患者ABI变化不明显。1例症状无明显改善。

　　2.2 随访情况 8例于术后1月症状出现反复，其中3例表现为跛行距离恢复至术前水平，2例术后有静息痛再次出现，3例表现为晚间患肢麻木、怕冷，无明显疼痛。1例患者于术后2月行膝下截肢手术，术中发现残端血运丰富，术后创面愈合良好。

　　2.3 疗效 4例足趾坏疽患者中：1例症状明显缓解，静息痛消失，行坏疽足趾切除，愈合良好。2 例疼痛消失，睡眠改善，坏疽组织有脱落迹象，未进一步处理。1例于膝下截肢时被截除。治疗前，患者缺血情况临床评分为(10.33±3.16)分。治疗后7 d临床评分为(6.33±2.42)分,治疗后2 w为(5±1.67)分，治疗后1月为(5±1.55)分,治疗后3月为(4.8±1.64)分，治疗后6月为(5±1.00)分，治疗后2 w患者缺血情况临床评分较治疗前降低1倍，差异显著(P<0.05)。治疗后3月患者缺血情况临床评分最低，仅为(4.8±1.64)分。

　　2.4 并发症 除1例于术后3月出现浅静脉曲张外，未发现明显并发症。所有患者均未恢复至正常水平。

　　3 讨 论

　　成体干细胞具有多分化潜能，可分化为血管内皮细胞,进一步分化形成新生毛细血管,自体干细胞移植正是利用这一原理，将干细胞移植到缺血的肢体肌肉中，使其分化、形成新生毛细血管，改善和恢复下肢血流，达到治疗下肢缺血的目的。机体在缺血时会代偿生成新生血管,这种新生有两种方式:血管生成和血管形成。前者是指通过血管内皮细胞迁移、增殖,在原有的血管上以出芽的方式生长出新的血管;后者是指在原来没有血管系统的情况下,通过血管内皮祖细胞(EPC)和造血干细胞的分化和相互作用产生新的血管〔3〕。传统观念认为血管生成仅存在于胚胎发育时期。已有大量实验证实EPC存在并参与了出生后新血管形成〔4〕。骨髓中具有EPC和间充质干细胞(MSC),一定条件下MSC可以定向分化成血管内皮细胞和平滑肌细胞。这为干细胞移植治疗下肢缺血提供了基础。动物实验已经证实来源于骨髓或外周血的干细胞能够在血管损伤部位分化形成新生血管，进而改善肢体血供。

　　本研究显示，自体骨髓干细胞移植治疗动脉缺血在短期内是有效的，治疗后3～5 d各项指标均有一个明显的改善，所有患者术后7 d时的临床评分均明显下降，1月后有所反复，3～4月后各项指标趋于稳定。作者认为治疗后第一天既表现出的肢体疼痛缓解和冷感减轻可能是移植的干细胞对局部组织的早期反应所致，因为治疗后早期不可能有真正的毛细血管新生。一般干细胞的分化、增殖、最后形成新生血管大约需要4 w左右时间，所以1个月后的疗效评定才具有临床意义。

　　一般来讲，为保证截肢创面愈合，截肢平面常选择在坏疽部位的近侧关节上方，即若踝关节处皮肤坏疽，截肢平面应选择在膝上。但是应用自体骨髓干细胞移植的方法治疗后的截肢者的截肢平面均较常规预测的截肢平面为低〔5〕,使大多数患者达到了降低截肢平面或避免截肢的目的。本组截肢病例，行膝下截肢且残端血运丰富，术后创面愈合良好，这可能与干细胞移植治疗有关。本组1例患者术后3个月出现浅静脉曲张、增多，可能与干细胞移植治疗致血管新生有关，但亦可能干细胞移植治疗后组织血供增加，静脉充盈，使原来未显示的曲张浅静脉得以显露，尽管患者否认浅静脉曲张病史。浅静脉曲张患者的出现，使得我们应当更严密、更长期的观察干细胞移植的并发症。自体干细胞移植治疗动脉缺血在理论上是成立的，大量的基础实验和临床研究表明，干细胞移植治疗动脉缺血性疾病包括肢体缺血的疗效是肯定的〔6～8〕，但对于能够应用传统的手术或介入手段解决病变的患者，仍不应作为首选。

　　综合本临床观察结果提示，自体骨髓干细胞移植对肢体疼痛、冷感、麻木、疗效确切，ABI增加，对糖尿病足溃疡愈合及截趾创面愈合有促进作用，能降低截肢平面，减少截肢(趾)率、再截肢率。另外还具有创伤小，适用于合并心脑血管疾病的无法接受常规手术或介入治疗的高龄患者。另外自体移植，不存在排异问题。操作简单、设备要求不高，易于推广。尽管自体骨髓干细胞移植仍处于探索阶段,但在早期的实验及临床治疗中已经显现出其优越性,且未发现明显副作用。相信随着研究的深入,自体骨髓干细胞移植将会有进一步的发展，将为重症下肢动脉缺血性疾病治疗开辟新途径。

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