外周血干细胞骨髓腔内输注对移植物抗宿主病的影响

作者：毕延智,曾冬香,盛桂凤,张琰,陈宝安    作者单位：苏州大学附属常州市肿瘤医院肿瘤内科，常州 213001

【摘要】  本研究建立髓腔内外周造血干细胞输注(IBMPBSCT)动物移植模型并观察该方法对移植物抗宿主病(GVHD)的影响。选取雌性C57BL/6小鼠为移植受鼠，于第0天接受全身照射(TBI) 4Gy后，输注经rhGCSF动员的雄性BABL/c小鼠外周血造血干细胞(1×107)，2天后腹腔注射环磷酰胺(CTX)，观察各组小鼠GVHD发生情况。结果显示：髓腔内PBSCT组的受鼠GVHD发生率较尾静脉输注组明显减低(p<0.05)，移植后在受鼠体内观察到供鼠来源的Y染色体存在。 结论：与尾静脉输注比较，髓腔内输注外周血造血干细胞不仅能减少GVHD的发生，而且更有利于干细胞植入。

【关键词】  移植物抗宿主病

    Influence of Intrabone Marrow Infusion of Peripheral Hematopoietic Stem Cells on  GraftVersusHost Disease

    BI YanZhi, ZENG DongXiang, SHENG GuiFeng, ZHANG Yan1, CHEN BaoAn1

    Department of Oncology, Changzhou Tumor Hospital, Suzhou University, Changzhou 213001, China; 1Department of Hematology, Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210009, China

    Abstract    This study was aimed to explore whether the graftversushost disease (GVHD) could be alleviated by intrabone marrow (IBM) infusion of allogeneic hematopoietic stem cells. Female C57BL/6 mice as recipients received total body irradiation (TBI) 4 Gy on day 0, followed by injection of peripheral hematopoietic stem cells (1×107) from mobilized male BALB/c with  granulocytecolony stimulating factor (rhGCSF), and cyclophosphamide (200 mg/kg) was injected intraperitoneally two days later. The results showed that the  incidence and severity of GVHD were more low and alleviative in group IBMPBSCT   than that  in group TVPBSCT (p<0.05). Y chromosome of doenor mice could be detected  in the bone marrow of recipient mice. It is concluded that the method of intrabone marrow infusion is superior to injection via the tail vein in the engraftment of hematopoietic stem cells in terms of stem cell homing while the frequency   and severity of GVHD in allogeneic mice decrease.

    Key words    hematopoietic stem cell transplantation; intrabone marrow infusion; graftversushost disease

    J Exp Hematol 2007; 15(5):1009-1012

    外周血来源的造血干细胞移植因其干细胞采集方便、供者痛苦少、移植后造血和免疫功能重建快等优势已成为目前治疗某些恶性血液病和自身免疫性疾病的重要方法，但移植后严重的移植物抗宿主病(GVHD)的发生在一定程度上限制了其应用。有证据表明，大量造血干细胞移植可以克服主要组织相容性复合物(MHC)屏障，促进造血干细胞的植入(大剂量效应)［1］。我们将供者骨髓细胞直接注入到受者骨髓腔内(IBMBMT)，成功建立了稳定的免疫耐受模型，且未观察到GVHD的发生［2］。在此基础上，我们进一步实验证实了重组人粒细胞集落刺激因子(rhGCSF)动员的外周血干细胞髓腔内输注较尾静脉输注更有利于促进嵌合体形成，减少GVHD发生，现报道如下。

    材料和方法

    实验动物

    供鼠为雄性BALB/c小鼠(H2d)，8-10周龄，体重18-20 g；受鼠为雌性C57BL/6小鼠(H2b,B6)，8-10周龄，体重18-20 g，均为清洁级，购自上海SLAC实验动物有限责任公司。

    主要试剂

    环磷酰胺（CTX）购于江苏恒瑞医药股份有限公司，重组人粒细胞集落刺激因子 (rhGCSF)： 75 微克/支，购于上海三维生物技术有限公司。

    供者外周造血干细胞动员和细胞悬液的制备

    BALB/c小鼠于移植前4天起给予rhGCSF (250 μg/kg)皮下注射，每日1次，末次注射2-3小时后无菌条件下自内龇静脉取血，置入含EDTA的抗凝管内，淋巴细胞分离液(密度1.077)水平离心30分钟，吸取单个核细胞，然后用0.01 mmol/l的PBS液漂洗2次后重悬细胞，调至所需细胞浓度1×109/ml和1×108/ml分别用于髓腔内移植和尾静脉移植。

    移植模型建立

    C57BL/6小鼠在移植前1周接受含红霉素(250 mg/L)和庆大霉素(320 mg/L)的饮水，并持续到移植后2周。移植当天受鼠接受60Co γ射线4 Gy全身照射（TBI），剂量率0.5 Gy/min。照射后4小时内进行干细胞髓腔内注射和尾静脉注射。髓腔内注射具体步骤如下：将受鼠腹股沟至膝关节间鼠毛刮去，用刀片在大腿作1个5   mm左右切口，膝关节弯曲90°，暴露胫骨近端，1 ml注射器针头通过髌骨韧带经胫骨关节面插入胫骨骨髓腔内，注入细胞。2 天后腹腔注射CTX  200 mg/kg。实验分为3组：对照组：仅接受TBI和CTX，不进行干细胞移植；TVPBSCT组：尾静脉输注（tail vein iufusion)外周造血干细胞1×107/0.1 ml；IBMPBSCT组：髓腔内输注外周造血干细胞1×107/10  μl。对照组小鼠5只，其余两组各12只。

    骨髓细胞染色体制备

    移植后第15天，取TVPBSCT组和IBMPBSCT组存活小鼠各3只，腹腔内注射0.1%秋水仙碱（4 mg/kg），3小时后脱臼处死，无菌取注射侧胫骨，冲洗骨髓腔制备骨髓细胞悬液，离心去上清液，加入37℃预热的0.075 mol/l KCl 8 ml，混匀，在37℃水浴中处理15-20分钟，室温下加入新鲜配制的固定液（甲醇∶冰醋酸3∶1）1 ml预固定，离心去上清液。加入固定液8 ml，固定30分钟，再次离心去上清液。重复上述操作1次。最后加入1 ml固定液，混匀。制片，油镜下计数Y染色体。

    移植物抗宿主病(GVHD)观察

    移植后每日观察各组小鼠体重、毛发、腹泻、体位、活动状况等，死亡小鼠取肝脏、脾脏、小肠和爪垫皮肤组织常规病理学检查，若小鼠出现弓背、翘毛、腹泻、精神萎靡和体重骤减等表现，肝、小肠和皮肤等组织病理学改变符合GVHD表现者，定为GVHD死亡。生存期超过30天定为长期生存。

    统计学处理

    采用SPSS 11.5统计软件进行处理，数据以均数±标准差（±SD）表示，两样本均数比较采用t检验，GVHD情况分析进行卡方检验，p<0.05为差异有统计学意义。

    结    果

    小鼠一般状况和GVHD

    移植后第5-6天开始，TVPBSCT组和IBMPBSCT组部分小鼠出现了弓背、翘毛、食欲下降、体重减轻、精神萎靡及腹泻等不同程度的GVHD表现，未予特殊处理，部分小鼠渐恢复正常，其中TVPBSCT组和IBMPBSCT组分别有3只和2只小鼠在移植后21天内死亡，病理检查符合GVHD表现。肝脏：肝细胞空泡样变，汇管区内有大量淋巴细胞浸润，可见灶状出血；脾脏：巢状结构破坏,可见大量散在浸润的淋巴细胞、出血坏死灶及含铁血黄素的沉积；小肠：肠粘膜水肿出血，固有层和基层有淋巴细胞浸润；皮肤：厚薄不均，真皮层内可见淋巴细胞浸润、胶原纤维肿胀。两组GVHD发病率分别为45.5%、33.3%，死亡率分别为27.3%和16.7%，两组比较有统计学意义（p<0.05）。对照组小鼠在TBI后2-3天开始出现活动减少、进食略减、体重不升或略有下降、毛发轻度紊乱等现象，10天左右恢复正常，未观察到明显GVHD表现，存活率100%。

    植入证据

    镜下计数30个核分裂相，在TVPBSCT组和IBMPBSCT组存活的雌性受鼠骨髓细胞中均可检测到Y染色体存在，其嵌合率在IBMPBSCT组为36.7%±4.1%，明显高于TVPBSCT组15.3%±2.8% (p<0.05)，提示供鼠来源的外周血干细胞成功植入，且髓腔内注射在保证干细胞植入方面优于尾静脉注射。

    讨    论

    造血干细胞从静脉输注到达骨髓是一个复杂的归巢过程，其中涉及肝、肺等脏器对干细胞的滞留作用，供者粘附分子和受者基质细胞表面受体相互作用等。为减少HSC在受体骨髓外器官组织的滞留而造成的损失，国内外学者曾尝试HSC的其他注射途径。如刘英等［3］将人脐血单个核细胞直接注入胚胎卵黄囊内进行SD大鼠宫内移植，植入率为89.7%，未发生GVHD。其他如门静脉注射、胸腺内注射等方法均有实验研究，但以上方法因技术难度大、设备条件限制、易于形成血栓等原因不易于临床的应用和推广。近年来已有大量的动物实验肯定了不同来源供体细胞通过骨髓腔内注射能有效地归巢并植入骨髓，迅速重建受体造血和免疫功能，减少GVHD，诱导同种异基因器官移植免疫耐受，提高受体生存率。Kushida等［4］应用IBMBMT技术，以正常C57BL/6小鼠为供体对狼疮性肾炎MRL/lpr小鼠行异基因骨髓移植，发现IBM组移植后3天供体源性骨髓细胞在受体注射侧及非注射侧胫骨骨髓中均占60%，脾脏中占40%，移植后10天在上述部位几乎达到100%，而TV组移植后3天供体源性细胞在骨髓中<10%，移植后10天为70%。孙爱红等［5］也报道髓腔内移植明显减少了脐血干细胞在外周循环中的滞留，移植后24小时在未注射侧的下肢骨骼中即可观察到荧光标记的供者干细胞存在，且髓腔内注射1×107和3×107个脐血干细胞达到了同样的移植效果。我们在实验中选取了1×107个外周造血干细胞进行髓腔内注射，结果显示与尾静脉输注相比，髓腔内输注更加有利于干细胞植入。髓腔内输注的直接优点在于：简化了造血干细胞的归巢过程；避免了骨髓细胞在受者血液循环中的损耗；相对大量的造血干细胞增加了归巢的竞争性。实验结果表明，具有较长临床应用历史的骨髓腔内输注技术可能是一种更加有效的造血干细胞输注手段。

    目前建立小鼠嵌合体模型的预处理方案多采用TBI联合CTX。文献报道近交系小鼠接受总剂量7-10 Gy(剂量率0.5-1.0 Gy/min)均能达到90%以上的死亡率，总剂量越大，则受照射小鼠的生存状态越差，发生的aGVHD也越严重［6］。Panigrahi等［7］对小鼠进行TBI（4Gy）后以异基因脾细胞诱导异体反应性淋巴细胞增殖，4天后以致死量TBI（9 Gy）或大剂量的CTX（200 mg/kg）处理，结果无1例受鼠出现GVHD表现，而对照组出现了典型GVHD表现。由此认为，TBI（9 Gy）或CTX（200 mg/kg）可以足够清除异体反应性淋巴细胞，减少严重GVHD的发生。我们选取4 Gy的亚致死剂量，在保证供者干细胞顺利植入的情况下尽量减少全身照射所带来的损伤，并在移植后第2天加用CTX，以清除同种异体反应性T细胞，抑制受者免疫系统，保证植入成功。实验中对照组小鼠即使不进行干细胞移植也未出现死亡，说明预处理方案为非清髓性的。本研究中所有接受髓腔内输注的受鼠无1例出现GVHD，其机制目前尚不清楚，这可能也是髓腔内输注的优点之一。我们推测原因有以下几方面：①由于使用非清髓性预处理方案，受者所受全身照射剂量小，对组织的损伤较小，释放的细胞因子、黏附因子和组织抗原较少；②供者不同来源的干细胞输入后所产生的异基因反应性淋巴细胞，可能被随后注射的CTX清除或抑制；③移植后诱导了稳定的免疫耐受状态［2］，因此GVHD反应轻甚至不发生。也有研究发现，在GCSF动员后CD3+细胞和CD4-CD8- T细胞数目增多，T淋巴细胞增殖反应能力下降，分泌功能有Th1向Th2转化的趋势［8］，这些功能改变可能也是实验中GVHD发生率降低的原因之一。

    目前已建立了以骨髓［4］、脐血细胞［5］、小鼠胚胎干细胞诱导分化的HSC［9］髓腔内移植动物模型，但尚未见有关动员的异基因外周造血干细胞移植动物模型。我们的研究显示髓腔内输注在减轻GVHD、促进干细胞植入方面均优于常规静脉输注，这为IBMPBSCT的临床应用提供了一定实验依据。

【参考文献】1Reisner Y, Martelli MF. Transplantation tolerance induced by “megadose” CD34+ cell transplants. Exp Hematol, 2000;28:119-127

2陈宝安, 毕延智, 丁家华等. 非清髓性骨髓移植诱导异基因受者小鼠免疫耐受的实验研究. 中国实验血液学杂志, 2005; 13:1054-1057

3刘英, 庄广伦, 游泽山等. 人脐血造血干细胞经鼠卵黄囊进行宫内移植的实验研究. 中华医学杂志, 2003;83:60-62

4Kushida T, Inaba M, Hisha H, et al. Intrabone marrow injection of allogeneic bone marrow cells: a powerful new strategy for treatment of intractable autoimmune diseases in MRL/lpr mice. Blood, 2001;97:3292-3299

5孙爱红, 冯四洲, 刘斌等.NOD/SCID小鼠脐血单个核细胞骨髓腔内移植的实验研究.中华血液学杂志, 2005;26: 261-264

6Ferrara JL, Cooke KR, Pan L, et al. The immunopathophysiology of acute graftversushostdisease. Stem Cells, 1996;14:473-489

7Panigrahi S, Morecki S, Yacovlev E, et al. A novel approach for prevention of lethal GVHD by selective elimination of alloreactive donor lymphocytes prior to stem cell transplantation. Exp Hematol, 2004;32:756-764

8陈松鹤, 黄晓军. rhGCSF动员正常人外周血干细胞过程中对T淋巴细胞增殖的影响.中华血液学杂志, 2003;24:420-422

9Burt RK, Verda L, Kim DA, et al. Embryonic stem cells as an alternate marrow donor source: engraftment without graftversushost disease. J Exp Med, 2004;199:895-904