我国汉族人群HLAⅠ类经典基因单倍型及连锁分析

作者：袁方， 孙玉英， 骆媛， 梁飞， 刘楠， 金荔， 刘金锋， 刘曙光， 奚永志    作者单位：军事医学科学院附属医院免疫学研究室及国家生物医学分析中心免疫实验室，北京 100071

【摘要】  本研究旨在探讨我国汉族人群HLAⅠ类经典基因座位HLAA、HLAB、HLACw位点的基因频率，单倍型频率及连锁特征。采用序列特异性引物(SSP) PCR低分辨基因分型技术对1 014例随机选择的无关个体的经典HLAⅠ类位点进行基因分型，并对其相关遗传学参数进行统计学分析。结果发现汉族人群中较为常见的HLAⅠ类基因是A*02(0.33)、A*11(0.24)、B*15(0.14)、B*13(0.13)、Cw*03(0.25)、Cw*07 (0.18)；较为常见的单倍型是A*02B*46(0.071)、A*11B*15(0.051)、A*02Cw*01(0.084)、A*11Cw*03(0.079)、B*46Cw*01(0.095)和B*13Cw*03(0.071)等，其中A*02B*46、A*30B*13、A*30Cw*06、 A*02Cw*01、B*46Cw*01和B*58Cw*03等单倍型呈现出显著的连锁不平衡；而A*02B*15、A*02B*40、A*24Cw*03、A*02Cw*03、A*31Cw*03等连锁不平衡性相对较低，其中A*24Cw*03在重组事件中较常出现。此外，A*02B*46Cw*01(0.075)、A*30B*13Cw*06(0.046)、A*11B*13Cw*03(0.045)、A*33B*58Cw*03(0.044)、A*11B*15Cw*08(0.027)、A*02B*38Cw*07(0.023)、A*11B*40Cw*07(0.022)等为常见扩展单倍型。结论： 本研究较系统地分析了我国汉族人群的HLA遗传学分布特点，为群体进化、临床移植及疾病相关研究等提供了有价值的遗传学资料。

【关键词】  遗传多态性

     Haplotype and Linkage Analysis of HLAI  Classical  Genes   in Chinese Han Population

    YUAN Fang,  SUN YuYing,  LUO Yuan,  LIANG Fei,  LIU Nan,  JIN Li,  LIU JinFeng,

    LIU ShuGuang  XI YongZhi

    Department of Immunology and National Center of Biomedicine Analysis,  The Hospital Affiliated to  Academy of Military Medical Sciences,  Beijing 100071, China

    Abstract    The aim of this study was to investigate the parameters of gene frequencies， haplotype frequencies and linkage disequilibrium of HLAA,B,Cw in HLA classical I loci for Chinese Han population. HLAA, HLAB and HLACw loci were genotyped in 1014 unrelated China people    using low resolution PCRSSP typing method, and their genetic parameters were analyzed by statistic methods. The results indicated that among all the detected HLAI genes, A*02(0.33), A*11(0.24), B*15(0.14), B*13(0.13), Cw*03(0.25) and Cw*07 (0.18)  were the popular gene groups distributing in Chinese Han population, and A*02B*46(0.071), A*11B*15(0.051), A*02Cw*01 (0.084), A*11Cw*03(0.079), B*46Cw*01(0.095) and B*13Cw*03(0.071)  were  the predominant haplotypes in Han population. Additionally, A*02B*46, A*30B*13, A*30Cw*06, A*02Cw*01, B*46Cw*01 and B*58Cw*03 were statistically significant with strong linkage disequilibrium. While A*02B*15, A*02B*40, A*24Cw*03, A*02Cw*03 and A*31Cw*03 were in low linkage disequilibrium，among them A*24Cw*03 appeared frequently in HLA recombination events. In addition，A*02B*46Cw*01 (0.075), A*30B*13Cw*06 (0.046), A*11B*13Cw*03(0.045), A*33B*58Cw*03(0.044), A*11B*15Cw*08 (0.027), A*02B*38 Cw*07(0.023) and A*11B*40Cw*07(0.022) were the main extended haplotypes in Han population. In conclusions, this study investigated systematically  the genetic polymorphism features of Chinese Han population, which may provide useful genetic parameters for researches in colonial evolution, clinical transplantation and disease susceptibility.

    Key words    HLAⅠ gene; genetic polymorphism; gene frequency; haplotype frequency; linkage disequilibrium

    J Exp Hematol 2007; 15(5):1084-1089

    人类白细胞抗原(HLA)是位于人类第6号染色体短臂上的一组紧密连锁的基因群，由HLAⅠ类、Ⅱ类、Ⅲ类基因组成，其编码产物可分布于不同类型的细胞表面，不但决定着宿主的组织相容性，而且参与宿主的免疫应答和免疫调节，其意义不仅限于移植免疫范畴，在机体防御外界细菌和病毒入侵以及自身免疫和某些传染性疾病相关联方面具有十分重要的意义［1］。HLA复合体通过基因突变、基因重组、基因转换等机制，导致其基因结构发生变异，因而呈高度的多态性，是人体最复杂的基因系统。HLA的基因分布，连锁不平衡性，都有显著的区域、人种、民族差异。因而，探讨我国汉族人群HLA基因频率、单倍性频率的系统性研究无疑会对人群的迁移、某些疾病的诊断治疗等方面产生重要意义。

    对象及标本收集

    样本取自2002年以来在我室进行HLA分型的骨髓移植患者及其家庭成员的血液留样，遵照家系随机抽取1人份的原则，抽取了1 014人份EDTA抗凝的冻存血。其中正常供者801人份，预接受骨髓移植的患者213人份；男性635人份，女性379人份；所选群体平均年龄38.7岁。对出现重组的9例家系，以及4个涵盖两代5人以上的家系都进行了家系分析。

    PCRSSP分型

    使用Dynal Biotech公司的QIAamp DNA Blood Mini kit提取试剂盒快速提取基因组DNA。经1％琼脂糖凝胶电泳显示，提取的DNA无降解现象，光吸收A260/A280比例在1.5-1.9，符合PCR反应的要求。采用Dynal Biotech公司的PelFreez Clinical System SSP试剂盒进行PCR(批号023－031)，HLAⅠ试剂盒包含96个PCR反应体系。取10μl PCR反应产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳，紫外检测仪下观察结果，指定基因型别。

    群体遗传学统计分析方法

    HLAⅠ类基因频率计算公式为：    Pi=X/2N ， 两位点单倍型频率估算公式为：   s=1+d/N-B/N-D/N ， 连锁不平衡参数的计算公式为：   Δ=s-pipj， Δ的标准误的公式为：  δ(Δ)=a4N2-ΔN(B+D2BD-BDN），相对连锁不平衡参数的公式为：  Δ（r）=Δ/Δ最大，在Δ/δ(Δ)≥1.96时，认为是显著连锁不平衡。三位点单体型频率估算公式颇为复杂，详见参考文献［2］。

    结    果

    HardWeinberg吻合度测验

    统计分析表明，HLAA、HLAB、HLACw 3个位点各自表型观察值与期望值无显著性差异，符合HardWeinberg 平衡(HLAA、HLAB位点p>0.4，HLACw位点 p>0.5)。此结果说明本实验选择的群体交配完全随机，自然选择、突变、迁移对该群体无显著影响，群体选择随机性强，适于进行统计分析。

    中国人群HLAA、HLAB、HLACw位点基因分布

    本研究共检测出15个HLAA基因型， 29个HLAB基因型， 13个HLACw基因型。最常见的是A*02(0.33)、A*11(0.24)、B*15(0.14)、B*13(0.13)、Cw*03(0.25)、Cw*07 (0.18)（具体内容另文发表）。

    HLAA、B、Cw基因两位点连锁单倍型频率

    统计结果显示，本次抽样人群常见的2位点单倍型是： A*02B*46(0.071)、A*11B*15(0.051)、A*02B*15(0.050)、A*11B*13(0.049)、A*02Cw*01(0.084)、A*11Cw*03(0.079)、A*02Cw*07(0.069)、A*02Cw*03(0.055)、B*46Cw*01(0.095)、B*13Cw*03(0.071)、B*40Cw*03(0.054)、B*58Cw*03(0.053)。通过连锁分析还发现A*02B*46、A*30B*13、A*33B*58、A*30Cw*06、A*02Cw*01、A*33Cw*03、B*46Cw*01、B*58Cw*03、B*51Cw*14等单倍型呈现出显著的连锁不平衡。A*02B*15、A*02B*40、A*24Cw*03、A*02Cw*03、A*31Cw*03等连锁不平衡性相对较低。结果详见表1-3，限于篇幅文中仅给出部分频率较高的单倍型资料。

    HLAⅠ类基因HLAA、B、Cw三位点连锁的扩展单倍型频率分析

    HLAA、B、Cw 3个位点都有很强的多态性，因而组合出的3位点扩展单倍型种类繁多，非大规模调查不足以得出可靠结果，故本文中仅给出了部分常见的单倍型频率结果,以供研究参考之用。我们发现A*02B*46Cw*01(0.075)、A*30B*13Cw*06(0.046)、A*11B*13Cw*03(0.045)、A*33等是最为常见扩展单倍型。为此，我们抽取了4个涵盖两代家系的大家系进行验证，先通过HLA表型排列出可能存在的基因型，并根据扩展单倍型频率逐个计算这些可能存在的基因型的频率，随后进行家系调查以明确其基因型。结果显示，理论频率最高的基因型是真实基因型，这从一个侧面对我们计算结果的可靠性提供了佐证（表4）。

    HLAA、B、Cw位点间的重组

    在众多的家系资料中，还发现了9例重组事件，重组率接近1％。其中有8例都是发生在HLA－A/Cw之间的重组，HLAB/Cw之间的重组1例。HLA－A/Cw之间的8次重组分别发生在如下单倍型之间：A*02Cw*03、A*33Cw*03； A*24Cw*03、A*02Cw*07；A*02Cw*03、A*24Cw*03；A*11Cw*07、A*31Cw*15；A*30Cw*06、A*31Cw*03；A*03Cw*12、A*02Cw*03；A*11Cw*14、A*02Cw*03；A*01Cw*12、A*02Cw*14。HLAB/Cw之间的重组发生在如下单倍型之间：B*13Cw*03、B*40Cw*15，其中A*02Cw*03单倍型出现4次，A*24Cw*03单倍型出现2次，其余各出现1次。

    讨    论

    本次抽样人群的HLAA、B、Cw基因频率分布同既往报道的汉族人群频率分布相似［3-5］。A*02、A*03的基因频率均大于0.3，远高于欧洲人、黑人及犹太人［2］；B*13、B*40基因频率亦超过0.1，而在其他种族则一般不超过0.05；B*54在欧美人群及黑人中极罕见，而我们统计的B*54频率则接近0.03；Cw*07也是在亚洲人群中常见的，其基因频率为0.181。从HLAⅠ类基因两位点连锁单倍型频率分析中，我们也可发现一些特点，例如A*02B*46(0.073)、A*02Cw*01(0.086)、B*46Cw*01(0.081)单倍型在本次研究中频率最高，而这些单倍型在欧洲白人、北美白人、澳大利亚白人、黑人及日本人中频率均很低［2］。因此，汉族人群具有自身的优势基因及单倍型，其频率分布具有明显的中国汉族人群频率分布特征，这对于我国汉族人群的相关医学研究提供了可靠的遗传学背景。

    连锁不平衡是HLA遗传的重要特点，某些组合的单倍型在遗传适应上具有优势；而某些组合的单倍型则相反。本研究进行连锁不平衡分析后，也发现了一些很有意义的结果。如 B*46、Cw*01各自的基因频率都不是最高，但B*46Cw*01单倍型在B、Cw位点中出现的频率却最高。通常我们认为Δ/δ(Δ)≥1.96即有显著连锁不平衡，B*46Cw*01单倍型的Δ/δ(Δ)比值更是高达15.647，相对连锁不平衡参数Δ(r)亦达到0.951，其中B*46基因频率为0.102， B*46Cw*01单倍型频率为0.095，可见B*46绝大多数都和Cw*01同时存在，B*46几乎就专属于B*46Cw*01。这一现象在B*39Cw*07中表现的尤为突出，B*39频率为0.017，B*39Cw*07频率也为0.017，凡B*39基因几乎都存在于B*39Cw*07单倍型中。同样A*30B*13中的A*30；A*33B*58中的B*58、A*30Cw*06中的A*30、B*58Cw*03中的B*58等等也有类似的现象，这在以往的文献中是未曾提及的。仔细分析这些依存及连锁关系，在基因分型时具有很好的实用价值。此外，我们知道人类6p21.31的HLAⅠ类基因区域，沿着丝点到端粒方向，依次是B、Cw、A基因座位。在分析中我们发现A*02B*46、A*30B*13、A*33B*58、A*30Cw*06、A*02Cw*01、A*33Cw*03、B*46Cw*01、B*13Cw*06、B*58Cw*03等单倍型都呈现出很强的连锁不平衡性，不难推测B*46Cw*01A*02、B*13Cw*06A*30、B*58Cw*03A*33在理论上应当是优势的扩展单倍型，当这些基因同时出现在同一个体时，通常作为一个整体向下一代传递，在遗传中不易产生交换，这和其它的文献报道极其相似［6］，本研究的家系分析结果也验证了这个推论。

    我们在1 014例个体所在的家系中还发现了9例重组家系，其中发生在HLAA、C间的重组就有8例，其重组率和国际上的报道是比较接近的［7］。在这些重组事件中，单倍型A*02Cw*03(Δ/δ(Δ)=3.000，Δ(r)=0.304)、A*24Cw*03(Δ/δ(Δ)=0.171，Δ(r)=0.008)出现不止一次，而这些恰恰是连锁不平衡性很低或是没有连锁不平衡性的单倍型。研究表明，大部分重组单体型的连锁不平衡程度都很低，这可能是其容易产生断裂发生重组的主要原因，大多数的学者也都认同重组率与连锁不平衡成反比的观点。这说明具有这些单倍型的染色体在遗传过程中发生交换重组的几率更大，从而易形成新的基因型或单倍型。但我们的调查中也有例外，如A*33Cw*03(Δ/δ(Δ)=7.221，Δ(r)=0.516)、A*30Cw*06 (Δ/δ(Δ)=10.370Δ(r)=0.930)和 B*13Cw*03(Δ/δ(Δ)=7.695，Δ(r)=0.386)。一方面这3条单倍体对应的另外1条单倍体的连锁不平衡度很低，它可能在重组中发挥主要作用；另一方面，连锁不平衡与重组率的关系尚不明确，也有文献对两者成绝对反比的关系持反对意见 ［8］。连锁不平衡从一定程度上反映了自然选择的作用，在随机交配的群体中，连锁不平衡度随着种群的进化都是在不断地下降的，有逐渐走向连锁平衡的趋势。

    本研究中，采用PCRSSP基因分型技术，以我国汉族人群为研究对象，涉及北京、广西、河南、四川、河北、江苏、辽宁、山东、新疆、山西、陕西等汉族聚集地区的千余例样本，基本上体现了汉族人群的基因特点，对遗传学、人类学、医学研究提供了重要的科学依据。 考虑到中国人群分布较广，有待增大样本量，提高HLA分型精度，进一步深入研究。

【参考文献】1Beck S, Geraghty D, Inoko H, et al. Complete sequence and gene map of a human major histocompatibility complex. Nature, 1999; 401（6756）:921-923

2谭建明,周永昌,唐孝达主编. 组织配型技术与临床应用. 北京：人民卫生出版社. 2002：62-131

3吴国光，邓志辉，高素青等. 6 965名汉族骨髓供者HLA多态性分析. 中华血液学杂志， 2004； 25:473-477

4马红京，尹晓林，郭坤元等. 广东汉族人群HLA Ⅰ、Ⅱ基因多态性及单倍型分析. 中华医学遗传学杂志， 2005；22:467-469

5高素青，吴国光，李兴茂等. 安徽汉族HLAA、B、DRB1基因多态性和单倍型的分布特征. 临床输血与检验， 2005； 7:161-169

6林琳，高小江，祝文华等. 用DNA分型研究中国人HLAA、C、B的部分单倍型.中华微生物学和免疫学杂志，1999；19:152-155

7Thomsen M, Neugebauer M, Arnaud J, et al. Recombination fractions in the HLA system based on the data set 'Provinces Francaises': indications of haplotypespecific recombination rate. Eur J Immunolgenet, 1994; 21:33-43

8Termijtelen A, D'Amaro J, vanRood JJ, et al. Linkage disequilibrium in HLA can not be explained by selective recombination. Tissue Antigens, 1995; 46:387-390