活血补肾合剂对C57BL/6小鼠皮肤血管新生及毛囊中血管内皮细胞生长因子表达的影响

作者：高尚璞，黄岚，杨新伟

【摘要】  通过观察C57BL/6小鼠皮肤局部血管新生及毛囊中血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）的表达，探讨活血补肾合剂促进小鼠毛发生长的可能机制。方法:以热松香和石蜡混合物脱毛法诱导C57BL/6小鼠休止期毛囊进入生长期，建立动物模型。90只小鼠随机分为活血补肾合剂组、养血生发胶囊组和模型组。造模后第1天起开始灌药，每天观察各组小鼠皮肤毛发生长情况，并分别于造模后第4、11、17天每组分批处死10只小鼠，病理切片计数拔毛部位的血管数，并以免疫组织化学方法检测毛囊中VEGF表达情况。结果:活血补肾合剂组局部新生血管数第4天时多于模型组（ P <0.05），第11天时明显多于养血生发胶囊组和模型组（ P <0.05）;活血补肾合剂组毛囊中VEGF的表达在第11天和第17天时均明显高于养血生发胶囊组和模型组（ P <0.05）。结论:活血补肾合剂可能是通过调节细胞因子水平，起到促进血管新生和毛发生长的作用。

【关键词】  中医药; 血管; 血管内皮细胞生长因子; 免疫组织化学; 毛囊; 小鼠

　活血补肾合剂（Huoxue Bushen Mixture， HXBSM） 是龙华医院皮肤科经验方，临床治疗脱发取得了良好的疗效［1］。本实验观察活血补肾合剂对小鼠毛发生长、局部血管新生及毛囊中血管内皮细胞生长因子 （vascular endothelial growth factor， VEGF）表达的影响，旨在从微观结构和细胞因子水平对活血补肾合剂促进毛发生长作用的机制加以阐释。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料

　　1.1.1 动物 C57BL/6小鼠，普通级，8周龄，体质量（20±2）g，雄性，由上海中医药大学实验动物中心提供。

　　1.1.2 药物来源与制剂加工 活血补肾合剂由地黄30 g、丹参40 g、益母草20 g、玄参15 g、黄芪 40 g 、党参20 g、麦冬15 g、猪苓20 g、金钱草40 g、白花蛇舌草40 g共10味中药组成，由龙华医院制剂室制备（沪药制字z05170520），含生药4 g/ml。养血生发胶囊（熟地黄、当归、羌活、木瓜、制何首乌等）由广州敬修堂药业股份有限公司生产，批号030263。生理盐水，上海市富民制药厂生产。

　　1.2 造模、分组及药物处理

　　1.2.1 动物模型建立 参考文献［2］建立动物模型，将按1∶1的比例混合的松香和石蜡加热融化后涂于C57BL/6小鼠背部，凝固变硬后揭去，从而达到脱毛的效果。每只小鼠脱毛区域约为2 cm×2 cm。

　　1.2.2 动物分组及药物处理 按《药理与中药药理实验》［3］人鼠等效剂量换算方法计算各种药物的人鼠等效剂量。C57BL/6小鼠，共90只，随机分为 3组 ，每组30只。活血补肾合剂组，以生药 25 g/（kg·d） 剂量灌饲;养血生发胶囊（Yangxue Shengfa Capsule， YXSFC）组，以0.36 g/（kg·d）剂量灌饲; 模型组，生理盐水0.4 ml/d灌胃。以上 3组 每天灌服药物1次，从造模后第1天起，连续给药17 d。

　　1.3 检测指标与方法

　　1.3.1 肉眼观察 各组小鼠拔毛局部皮色变化及毛发生长情况。

　　1.3.2 光学显微镜下观察 分别于造模后第4、 11天 用断颈法每组随机处死10只小鼠，第17天用 同样方法处死各组剩余小鼠。在每只小鼠拔毛部位切取新鲜皮肤标本，固定于10%中性甲醛，经脱水，透明，渗蜡，包埋，连续切片，并进行HE染色，观察真皮浅层毛细血管数（条）。以200倍视野计数，每张切片数5个视野，计算平均值［4］。

　　1.3.3 检测VEGF表达 采用免疫组织化学法。

　　1.3.3.1 检测方法 免疫组化Envision二步法测定VEGF（VEGF抗体为Santa Cruz Biotechnology 公司产品，工作浓度1∶25～1∶50），与HE染色同步进行。

　　1.3.3.2 图像分析 采用Leica DMIRB倒置像差显微镜和 Leica Q 500 IW图像分析仪，选择200倍视野，每张免疫组化切片任选2个视野，分析视野中免疫组化切片染色阳性面积占整个视野面积的百分比。

　　1.4 统计学方法 实验数据用 x ± s 表示。采用SPSS for Windows软件包进行完全随机设计资料的两因素方差分析。　　　　2 结果

　　2.1 各组小鼠拔毛局部毛发生长情况 各组小鼠在造模时皮肤均为粉红色;HXBSM组和YXSFC组在造模后第4～5天局部皮肤变黑，第8～9天出现新生毛发，第17天皮肤变灰;而模型组约在第 6天 皮肤变黑，第11天出现新生毛发，第17天皮肤变灰。其中皮肤变黑的时间头端早于尾端。

　　2.2 对小鼠皮肤局部血管新生的影响 因实验过程中有动物死亡，各组第4和11天均处死10只，第17天HXBSM组和YXSFC组均处死9只，模型组处死8只。同组小鼠不同时间拔毛局部真皮浅层毛细血管数相比，HXBSM组在造模后第11天和第17天时明显多于第4天（ P <0.05），模型组第 17天 时明显多于第4天和第11天（ P <0.05）;同一时间不同组别相比，第4天和第11天时HXBSM组新生血管数较模型组增加（ P <0.05），YXSFC组第11天时新生血管数较模型组增加（ P < 0.05 ）;而第11天时，HXBSM组明显多于YXSFC组（ P <0.05）;第17天时，3组小鼠局部毛细血管数目相比，差异无统计学意义（ P >0.05）。见表1。

　　2.3 对小鼠皮肤局部毛囊中VEGF表达的影响 同组小鼠不同时间拔毛局部毛囊中VEGF的表达相比，HXBSM组和YXSFC组在造模后第11天高于第4天（ P <0.05），第17天高于第11天和第 4天 （ P <0.05）;模型组在第11天和第17天高于第4天（ P <0.05），而第11天和第17天相比，差异无统计学意义（P>0.05）。同一时间不同组别相 比，第4天时各组小鼠毛囊中VEGF的表达量差异无统计学意义（ P >0.05）;第11天和第17天时，HXBSM组VEGF的表达量高于YXSFC组和模型组（ P <0.05）;第17天YXSFC组VEGF的表达量高于模型组（ P <0.05）。见表1、图1。

　　表1 各组小鼠局部血管新生和皮肤局部毛囊中VEGF表达（略）

　　Table 1 Skin blood vessel neogenesis and expression of VEGF in hair follicle of mice in three groups

　　*P <0.05， vs day 4;△P <0.05， vs day 11;▲P <0.05， vs untreated group;□P <0.05， vs YXSFC group.

　　图1 第11天各组毛囊中VEGF的表达情况（略）

　　Figure 1 The eleventh day's VEGF expression of mice hair follicle in three groupsA: HXBSM group; B: YXSFC group; C: Untreated group.

　　3 讨论

　　临床上，我们发现脱发患者以青壮年居多。患者生活节奏快，心理压力大，造成劳伤心脾，或肝郁气滞，或暗耗肾精。由此导致了湿阻、血瘀或肾虚，气血不能上达头部，毛发失于精血的濡养而脱落。故治疗脱发应以“活血、利湿、补肾”为治则，而活血补肾合剂正是以这一原则组方。我们临床以该方治疗肾虚血瘀型脱发，为期3个月的临床观察显示，治疗组痊愈率和显效率分别为44%和36%，明显优于首乌片对照组的12%和28%（ P <0.05），并且对头痛失眠、腰酸乏力等肾虚血瘀的证候改善也明显优于首乌片对照组（ P <0.05）［5］。本实验所选的C57BL/6小鼠在6～8周饲养良 好的情况下，所有毛囊均由生长期进入休止期，且生理状态下不再自发进入生长期。经人工脱毛或拔毛等创伤刺激后可诱导其毛发进入生长期，并可自发经过退行期再进入休止期。这个周期活动与自然周期无明显差别［6］。该小鼠躯干皮肤的黑素细胞只存在于毛囊中，而且仅在生长期合成黑素并传递给角质形成细胞，使皮肤变成黑色，而退行期皮肤变成灰色，休止期皮肤变为粉红色，因此可根据皮肤颜色大致判断毛发周期与毛发生长情况［2］。本研究观察各组小鼠毛发生长情况，HXBSM组小鼠毛发进入生长期和长出的时间均早于模型组，而各组进入退行期的时间相当，表明活血补肾合剂可促进小鼠毛发进入生长期，并可促进毛发生长，但不能延长或缩短小鼠毛发固有的自然周期。Castex-Rizzi等［7］发现VEGF及其受体仅在生长期毛囊（主要在外毛根鞘、毛母质和毛乳头）表达，进入退行期后逐渐降低，在休止期则基本消失，进一步证实VEGF对毛囊生长周期和毛发生长具有正相调节的重要作用。本研究结果则表明，活血补肾合剂可明显提高小鼠拔毛局部毛囊VEGF的表达。推测活血补肾是通过调节细胞因子水平，达到促进血管新生、促进毛发生长的作用。 　　

【参考文献】  　1Li YM， Song Y， Ma SY. Observation of curative effects of Huoxue Bushen Mixture on 317 patients with alopecia. Zhejiang Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 2004; 14（7）: 440-441. Chinese. 李咏梅， 宋瑜， 马绍尧. 活血补肾合剂治疗脱发317例疗效观察. 浙江中西医结合杂志. 2004; 14（7）: 440-441.

　　2Slominski A， Paus R. Melanogenesis is coupled to mu-rine anagen: toward new concepts for the role of mela-nocytes and the regulation of melanogenesis in hair growth. J Invest Dermatol. 1993; 101（1 Suppl）: 90s-97s.

　　3Zhang DF. Experiments of pharmacology and tradition-al Chinese medicine pharmacology. Shanghai: Shang-hai Scientific and Technical Publishers. 2002: 8-10.Chinese. 张大方. 药理与中药药理实验. 上海: 上海科学技术出版社. 2002: 8-10.

　　4Wang T， Song HY， Zhang WM. Hair growth effect of Zhituo Shengfa Tincture. Shanghai Shi Yan Dong Wu Ke Xue. 2004; 24（2）: 99-100， 108. Chinese. 王婷， 宋怀燕， 张文明. 止脱生发酊生发作用的实验研究. 上海实验动物科学. 2004; 24（2）: 99-100， 108.

　　5 Gao SP， Li YM， Gu MJ. Clinical observation of “Huoxue Bushen Mixture” in treating alopecia areata of kidney deficiency and blood stasis. Shanghai Zhong Yi Yao Za Zhi. 2005; 39（7）: 39-41. Chinese with ab-stract in English. 高尚璞， 李咏梅， 顾敏婕. 活血补肾合剂治疗肾虚血瘀型斑秃的临床观察. 上海中医药杂志. 2005; 39（7）: 39-41.

　　6Paus R， Handjiski B， Czarnetzki BM， et al. A murine model for inducing and manipulating hair follicle re-gression （catagen）: effects of dexamethasone and cy-closporin A. J Invest Dermatol. 1994; 103（2）: 143-147.

　　7Castex-Rizzi N， Lachgar S， Charveron M， et al. Impli-cation of VEGF， steroid hormones and neuropeptides in hair follicle cell responses. Ann Dermatol Venereol. 2002; 129（5 Pt 2）: 783-786.