健脾活血方对酒精复合内毒素脂多糖诱导的肝损伤大鼠库普弗细胞活化信号通路的干预

作者：彭景华，方志红，崔剑巍，冯琴，许丽莉，顾宏图，胡义扬

【摘要】  观察健脾活血方对酒精复合内毒素脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）诱导的肝损伤大鼠库普弗细胞活化信号通路的影响。方法:采用Lieber-Decarli酒精饮料饲养6周诱导的酒精性肝损伤模型，分设正常组，无酒精饮料组，酒精饮料组和酒精饮料加健脾活血方组，造模第3周起灌胃给药或蒸馏水至第6周末，各组再以LPS 10 mg/kg 一次性灌胃，3.5 h后取材。检测血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase， ALT）活性和肝组织甘油三酯（triglyceride， TG）含量;HE染色观察大鼠肝组织病理改变;CD68免疫组化观察库普弗细胞活化状态;ELISA法检测门脉血浆肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）含量;Western-blotting方法检测肝组织TNF-α、磷酸化的IκB（phosphorylation-IκB， P-IκB）、Toll样受体4（Toll-like receptor 4， TLR4）、CD68蛋白表达。结果:经健脾活血方干预后，大鼠肝脏组织病理损伤减轻，肝组织TG含量以及血清ALT活性和门脉血浆TNF-α含量下降;同时，大鼠肝脏TNF-α、P-IκB、TLR4和CD68蛋白表达明显减轻。结论:健脾活血方对酒精复合LPS诱导的肝损伤大鼠CD68、TLR4、P-IκB和TNF-α具明显抑制作用。　　

【关键词】  肝疾病， 酒精性

　酒精性肝病长期以来是西方国家的主要肝脏疾病之一，而近年来的流行病学调查资料显示，其发病率在我国也呈现逐年上升的趋势［1］。目前，围绕“二次攻击”学说， 内毒素或脂多糖（lipopolysaccharides， LPS） 激活肝脏库普弗细胞产生炎症细胞因子是酒精性肝损伤研究的热点之一。现已知，LPS经内毒素受体如CD14、Toll样受体4（Toll-like receptor 4， TLR4）的作用激活肝脏库普弗细胞，活化核因子κB（nuclear factor κB， NF-κB）信号启动炎症因子如肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）的转录，导致肝损伤。我们前期的研究结果已经证实，中药复方健脾活血方具有抗Lieber-Decarli酒精饮料诱导的大鼠酒精性肝损伤的作用，并且进一步证实该方能够通过抑制酒精引起的肠渗漏［2］及脂质过氧化［3］来达到上述的药理作用。为了进一步探讨健脾活血方抗酒精性肝损伤的作用机制，本文观察了该方对于Lieber-Decarli酒精饮料复合LPS灌胃二次攻击诱导的大鼠肝损伤模型中LPS激活肝脏库普弗细胞信号通路的影响，现报道如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 动物和药物 SD雄性大鼠42只，体质量150～160 g，购自中国科学院上海实验动物中心。健脾活血方由白术、白芍、丹参、泽泻、五味子、姜黄、枳壳和葛根等组成。先提取药物（白术和枳壳等）中的挥发性成分，然后再将药物水提，最后将挥发油成分混合入水提物中。动物用药生药含量为 0.9 g/ml 。

　　1.1.2 主要试剂 Lieber-Decarli酒精饲料:无水乙醇，购自上海振兴化工一厂产品，分析纯AR，批号200402359;干酪素，L-胱氨酸，DL-甲硫氨酸，玉米油，橄榄油，红花油，麦芽糖糊精，纤维素，水溶性膳食纤维，酒石酸氢胆碱，黄原胶，磷酸氢钙，氯化钠，柠檬酸钾，硫酸钾，氧化镁，硫酸锰，硫酸亚铁，碳酸锌，碳酸铜，碘酸钾，亚硒酸钠，硫酸铬钾，氟化钠，蔗糖，盐酸维生素B1，核黄素，盐酸维生素B6，烟酸，泛酸钙，叶酸，维生素H，维生素B12， 乙酸维生素A， 维生素D3，乙酸维生素E，甲基萘醌亚硫酸氢钠，对 氨基苯甲酸，肌醇，右旋糖，中国医药（集团）上海化学试剂公司产品。LPS（Escherichia coli 0111:B4），为美国Sigma公司产品，实验时用灭菌注射用水溶解，工作终浓度1 mg/ml。检测试剂:丙氨酸氨基转移酶（alanine amin-otransferase， ALT）测定试剂盒，为卫生部上海生物制品研究所产品;甘油三酯（triglyceride， TG）测定试剂盒，为浙江东瓯生物工程有限公司产品。大鼠血浆TNF-α检测试剂盒，为R&D公司产品;DAB浓缩显色液和小牛血清白蛋白，均为上海华美生物工程公司产品;胃蛋白酶和多聚赖氨酸，均为北京鼎国生物技术公司产品;二甲苯和苏木素染料，均为上海化学试剂厂产品;中性树胶，为上海标本模型厂产品;30%过氧化氢，为上海桃浦化工厂产品;苯甲基磺酰氟，为Serva公司产品;三氨基甲烷，为上海生物工程公司产品;β巯基乙醇、吐温20、十二烷基硫酸钠、N，N，N'，N'-四甲基乙二胺、甘氨酸和40%Acr/Bis溶液，均为Bio-Rad公司产品;甲醇，为Burdick & Jackson公司产品;硝酸纤维素膜和溴酚蓝，均为Amersham公司产品。Nonidet P40和蛋白酶抑制剂，均为Roche公司产品;化学发光底物，为Pierce公司产品;脱脂奶粉，为Nestle公司产品;医用X光胶片（12.7 cm×18.7 cm），为上海海鸥照相机有限公司感光材料厂产品;多克隆羊抗大鼠TNF-α抗体，为R&D公司产品。单克隆小鼠抗大鼠磷酸化IκB抗体（phosphorylation-IκB， P-IκB），为Cell Signaling Technology公司产品;多克隆羊抗大鼠TLR4抗体，为Santa Cruz Biotechnology公司产品;单克隆小鼠抗大鼠CD68抗体，为Serotec公司产品;多克隆兔抗羊Ⅱ抗，为Jackson Immu-noresearch Laboratories Inc公司产品;单克隆兔抗小鼠Ⅱ抗，为Santa Cruz Biotechnology公司产品。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 造模与分组 参照Lieber-DeCarli酒精饲料配方和美国杰弗逊大学医学院酒精性肝病研究中心相关饲养方案，42只大鼠随机分正常对照组（ 6只 ）;酒精液体饲料组（24只）和无酒精液体饲料组（简称对照组，12只），均单居。除正常组外，分别采用特制负压式带刻度玻璃容器，每日消毒后定量饲以酒精热量占36%的Lieber-DeCarli酒精饲料和含相同热量的无酒精对照饲料。第3周起，酒精液体饲料组再次随机分为酒精液体饲料组（简称模型组，12只）、酒精液体饲料加健脾活血方组（简称中药组，12只）。中药组在给予酒精饲料的同时，灌胃给药0.01 ml/g，1次/d，正常组、模型组和对照组按相同标准给予蒸馏水。

　　1.2.2 取材 造模6周后，大鼠禁食5 h，分别灌服LPS 10 mg/kg（间隔10 min灌1只），并在灌服LPS 3.5 h后，分别采取门静脉血（无热源肝素抗凝管收集制备血浆）、下腔静脉血和肝组织。

　　1.2.3 观察项目和方法 （1）大鼠一般状态、进食量及体质量变化。（2）肝组织病理变化:HE染色，光镜下观察肝组织炎症变化和脂肪变性程度。 （3）血 清ALT活性和肝组织TG含量:采用生化试剂盒检测。（4）门脉血浆TNF-α含量测定:采用ELISA试剂盒测定。（5）肝组织CD68蛋白表达及分布:免疫组化染色法。Ⅰ抗，PBS稀释，工作浓度1∶100;Ⅱ抗，PBS稀释，工作浓度1∶250。（6）肝组织CD68、TLR4和TNF-α蛋白表达:Western-blotting法。

　　1.3 统计学方法 使用SPSS 11.0软件包进行统计学分析，计量资料用 x ± s 表示，组间两两比较用 t 检验。

　　2 结果

　　2.1 一般状态、进食量及体质量变化 对照组1只大鼠在灌饲LPS时意外死亡。各组大鼠进食量和热卡摄入无明显差异，排除饮食及酒精量的差异对实验结果的影响。造模前后同期各组大鼠体质量无 明显差异。

　　2.2 肝脏病理变化 模型组大鼠视野内1/3以上的肝细胞出现脂肪变性，以肝腺泡3带为中心，其余的大部分肝细胞变性、肿胀，胞浆内充满小的空泡，即以酒精性脂肪肝病理表现为主。中药组大鼠肝细胞脂肪变性程度明显减轻，脂滴数量减少。此外，对照组大鼠有3只也偶见有散在小泡状脂肪滴。见图1。

　　2.3 肝脏TG含量变化 模型组肝TG含量为正常组的9.4倍和对照组的4.9倍。健脾活血方可以明显降低肝组织TG含量，中药组TG含量均值为模型组的67%。见表1。

脉血浆TNF-α含量和血清ALT活性的变化 模型组门静脉血浆TNF-α含量和血清ALT活性明显高于正常组和对照组。而中药组的上述指标均明显低于模型组。见表1。

　　2.5 肝脏库普弗细胞活化状态 CD68免疫组化染色显示，正常组和对照组大鼠肝脏肝小叶汇管区肝窦内可见极少量CD68阳性染色。模型组大鼠肝脏可见明显的CD68阳性染色区域，集中在肝细胞脂肪变性及炎细胞浸润明显的汇管区肝窦内。中药组大鼠CD68阳性染色较模型组明显减少，但分布同模型组。见图1。

　　2.6 肝组织CD68、TLR4、P-IκB和TNF-α蛋白表达的变化 正常组大鼠肝组织CD68、TLR4、P-IκB和TNF-α蛋白均有少量表达，对照组TNF-α蛋白表达也略有增加，模型组大鼠肝组织CD68、TLR4、P-IκB和TNF-α蛋白表达则均明显增加，而中药组的上述蛋白表达均明显低于酒精模型组。见图2。

　　图1 各组大鼠肝组织HE染色和CD68免疫组化染色（×200） （略）

　　Figure 1 HE staining for liver tissue and immunohistochemical staining for CD68 （×200）

　　A: HE staining for liver tissue; A1: Normal group; A2: Control liquid diet group; A3: Ethanol liquid diet group; A4: Jianpi Huoxue Decoction group. B: Immunohistochemical staining for CD68; B1: Normal group; B2: Control liquid diet group; B3: Ethanol liquid diet group; B4: Jianpi Huoxue Decoction group.

　　表1 大鼠肝组织TG含量、血浆TNF-α含量和血清ALT活性的变化（略）

　　Table 1 Contents of TG in liver， TNF-α in portal vein plasma and activity of ALT in serum

　　*P <0.05，*P <0.01， vs ethanol liquid diet group;△P <0.05，△△P <0.01， vs control liquid diet group.

　　图2 健脾活血方对酒精性肝损伤复合LPS攻击大鼠肝组织CD68、TLR4、P-IκB 、TNF-α蛋白表达的影响（Western-blotting）（略）　　　　Figure 2 Effects of Jianpi Huoxue Decoction on protein expressions of CD68， TLR4， P-IκB and TNF-α in rats with liver injury induced by Lieber-Decarli diet and LPS （Western-blotting）

　　1: Normal group; 2: Control liquid diet group; 3: Ethanol liquid diet group; 4: Jianpi Huoxue Decoction group;

　　*P <0.05，*P <0.01， vs ethanol liquid diet group.

　　3 讨论

　　近年来，由于“二次攻击”学说被不断深入广泛地研究，酒精性肝病的发病机制研究取得了较大进展。LPS是革兰阴性菌细胞膜的主要脂质成分，可以激动强烈的炎症反应。大量研究表明，LPS通过活化库普弗细胞（即肝巨噬细胞）产生炎症因子参与了酒精性肝损伤的病理过程，库普弗细胞源性的TNF-α在实验性酒精性肝病中发挥了重要的病理作用［4］。嗜酒者空肠微生物系中，革兰阴性菌含量明显增高［5］。长期饲喂酒精的大鼠，用抗生素对其进行肠内灭菌或饲以乳酸菌，可降低酒精饲喂大鼠内毒素水平和肝损伤的程度，防止转氨酶的升高［6］。LPS体内主要来源于肠道革兰阴性杆菌。长期的酒精作用可致使肠道通透性发生改变引起肠渗漏［7］，从而使肠道内的内毒素进入血液。LPS信号的传递依赖于LPS受体的存在与活化。已经证实TLR4是革兰阴性菌LPS特异性受体［8］。TLR4基因突变的C3H/HeJ小鼠经4周胃内酒精灌注后，肝组织损 伤程度、转氨酶水平、TNF-α mRNA表达水平均较野生型对照组明显减轻［9］。LPS同血液中的LPS结合蛋白（LPS binding protein， LBP）形成复合物与效应细胞膜上的膜型CD14相结合，在低浓度下激活效应细胞（如单核/巨噬细胞，库普弗细胞等）［8］。由于CD14缺乏跨膜功能区，LPS-LBP复合物与库普弗细胞表面的CD14结合后，在模式识别受体TLR4的参与下完成信号转导。TLR4下游信号通过胞内一系列受体相关信号分子的参与最终诱导I-κB发生磷酸化降解，使NF-κB转位进入细胞核启动炎症因子如TNF-α的转录，从而导致肝损伤。中医对于酒精性肝病有“伤酒”、“胁痛”、“酒癖”、“酒疸”和“酒臌'等病名，认为饮酒为外因，而素体禀赋不足、脾胃虚弱为内因，健脾等调理脾胃运化功能的治疗方法是临床治疗酒精性肝病的基本治法治则。我们根据中医基础理论及长期的临床实践总结了治疗酒精性肝病的有效方剂健脾活血方，并经前期的动物实验已经证实该方具有抗酒精性肝损伤的药理作用。本研究重点观察了健脾活血方对Lieber-Decar-li酒精饮料诱导的大鼠酒精性肝损伤复合LPS灌胃二次攻击模型中LPS诱导库普弗细胞活化信号通路的影响。大鼠肝脏组织病理学、血清ALT水平的观察结果提示，该方能够有效地抑制Lieber-Decarli酒精饮料复合LPS灌胃二次攻击所致的肝损伤。同时，门脉血浆TNF-α含量、肝组织TNF-α蛋白表达检测结果均提示该方能够显著降低造模后大鼠体内TNF-α的表达，即健脾活血方能够抑制该模型中炎症因子TNF-α的释放。进一步观察LPS活化库普弗细胞信号通路的上游P-IκB及LPS受体表达情况发现，经健脾活血方干预后，大鼠肝脏P-IκB和TLR4的蛋白表达明显较模型组减轻。同时，免疫组化与Western-blotting检测的结果也表明作为库普弗细胞表面标志分子的CD68蛋白表达在该方干预后明显较模型组减轻，即健脾活血方能够抑制该模型大鼠肝脏库普弗细胞的活化。本研究的结果提示，健脾活血方具有抑制Lieber-Decarli酒精饮料复合LPS灌胃二次攻击所致的肝损伤及炎症因子TNF-α释放的药理作用。同时，该方对肝脏库普弗细胞活化及LPS受体TLR4蛋白表达也具有明显的抑制作用。

【参考文献】  　1Zhuang H. Epidemiology of alcoholic liver disease. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 2003; 11（11）: 689. Chinese. 庄辉. 酒精性肝病的流行病学. 中华肝脏病杂志， 2003; 11（11）: 689.

　　2Hu YY， Fang ZH， Cui JW， et al. Relationship betweenalcoholic liver injury and gut permeability and the alle-viating effect of Chinese herbs. Ke Xue Ji Shu Yu Gong Cheng. 2005; 5（22）: 1770-1771， 1776. Chinese with abstract in English. 胡义扬， 方志红， 崔剑巍， 等. 酒精性肝损伤与小肠通透性改变的关系及中药的干预作用. 科学技术与工程. 2005; 5（22）: 1770-1771， 1776.

　　3Cui JW， Hu YY， Fang ZH， et al. Intervention effects of Jianpi Liqi Huoxue Decoction on lipid peroxidative liver injury induced by alcohol. Chin J Integr Med. 2006; 12（4）: 281-286.

　　4Tsukamoto H， Lu SC. Current concepts in the patho-genesis of alcoholic liver injury. FASEB J. 2001; 15（8）: 1335-1349.

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　　6Adachi Y， Moore LE， Bradford BU， et al. Antibiotics prevent liver injury in rats following long-term exposure to ethanol. Gastroenterology. 1995; 108（1）: 218-224.

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　　8Su GL. Lipopolysaccharides in liver injury: molecular mechanisms of Kupffer cell activation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2002; 283（2）: 256-265.

　　9Uesugi T， Froh M， Arteel GE， et al. Toll-like receptor 4 is involved in the mechanism of early alcohol-induced liver injury in mice. Hepatology. 2001; 34（1）: 101-108.